3-MA抑制自噬在胰腺癌细胞抵抗失巢凋亡中的作用
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中山大学 硕士学位论文 3-MA抑制自噬在胰腺癌细胞抵抗失巢凋亡中的作用 姓名：庄燕妍 申请学位级别：硕士 专业：内科学 指导教师：张世能 20100527
３－ＭＡ抑制自噬在胰腺癌细胞抵抗失巢凋亡中的作用
中山大学附属孙逸仙纪念医院消化内科 学位申请人：庄燕妍 导师：张世能教授
摘 研究背景
要
胰腺癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）是一种常见的消化道恶性肿瘤，其恶性程度高， 疾病进展快，早期转移率高，中位生存期短，５年生存率不超过５％，死亡率接近 发病率，预后恶劣。由于胰腺癌发病的隐蔽性，缺乏早期的临床表现及症状的非 特异性，因此确诊时往往已属晚期，丧失根治性手术的机会，即使是早期诊断并 行了根治手术的病人，长期生存率仍低于１５％，且存在术后容易复发的问题。大 部分临床患者仅能行姑息手术结合术后辅助化疗或者直接放化疗，不幸的是，胰 腺癌对放化疗并不敏感。胰腺癌预后差、容易复发的主要原因正是其早期转移率 高，因此，防治胰腺癌转移是关键。 正常上皮细胞具有黏附依赖性，失去细胞问或细胞与基质接触将导致细胞程 序性死亡，即失巢凋ｌ＝（ａｎｏｉｋｉｓ）。失巢凋亡被认为普遍参与机体发生、发育、更 新及退化的全过程，例如体内的各种空腔组织如肠管等的形成，此外还可防止脱 落的细胞种植并生长于其他不适宜的地方，对于维护组织内环境稳定和结构完整 具有重要意义。但当这种生理诱导机制发生异常则会导致疾病病理过程的发生， 如目前认为失巢凋亡也参与心血管疾病及某些皮肤疾病的发生。而其在肿瘤侵袭 转移过程中的关键作用是目前研究的热点之一。目前认为，肿瘤细胞尤其是恶性 程度高的肿瘤细胞具备抵抗失巢凋亡的能力。肿瘤转移是个多阶段的过程，涉及 基质降解、肿瘤细胞游走浸润、肿瘤细胞再黏附等过程，当肿瘤细胞由于某个基 因缺失、突变或者某个凋亡信号通路的缺陷而具备了抵抗凋亡的能力，则在其脱 离原发灶进入血液或淋巴循环系统，失去基质支持，发生侵袭转移时即不发生失 巢凋亡，从而实现远处重定植形成转移灶的过程，这个结论在卵巢癌、口腔鳞癌、
数据以均数４－标准差表示，两组均数间比较采用ｔ检验，多组均数间比较采 用单因素方差分析。应用ＳＰＳＳ 著性差异水平为Ｐ＜０．０５。
１ ３．０ ｆｏｒ
ｗｉｎｄｏｗｓ统计软件进行统计学处理，显
结果：
１．胰腺癌细胞具有抵抗失巢凋亡的能力：胰腺癌细胞ＰＡＮＣｌ在软琼脂培养 ２周后处理组（５
ｍｍｏｉ／Ｉ
３－ＭＡ）形成集落数为７．００４－２．６５个，对照组为１３．５０士６．６０
实验方法和分组： ｌ、细胞培养 胰腺癌细胞株ＰＡＮＣｌ、ＳＷｌ９９０：常规培养在含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ．１６４０ 培养基。 永生化胰腺导管上皮细胞Ｈ６Ｃ７：常规培养在ＫＳＦＭ培养基。 ２、实验分组：Ｉ：悬浮处理组（５ｍｍｏｌ／ｌ，１０ｍｍｏｌ／ｌ，２０ｍｍｏｌ／Ｉ ３－ＭＡ）２：悬浮对 照组３：贴壁处理组４：贴壁对照组。 ３、软琼脂培养基培养法观察处理组及对照组的集落形成情况。 ４、Ｐｏｌｙ—ＨＥＭＡ悬浮培养法诱导失巢凋亡。
３．５ ｍｍｏｌ／１
３－ＭＡ对ＳＷｌ９９０凋亡率的影响呈时间依赖性：悬浮培养会诱
导ＳＷｌ９９０细胞凋亡，随时间延长呈上升趋势；悬浮处理组３－ＭＡ作用１２ｈ及 ２４ｈ皆较对照组失巢凋亡率增加。 ４．３－ＭＡ作用２４ｈ对胰腺癌细胞株ＳＷｌ９９０凋亡的影响呈剂量依赖性：随
着３－ＭＡ浓度的提高，凋亡率呈现上升趋势。
ｏｒ ｃａｎｃｅｒ
ｉｓ
Ｃｅｌｌ ｔｏ ｍａｔｒｉｘ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｈａｖｅ
ｍａｊｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ
ｕｐｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖｌ
ｃｅｌｌｓ，ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ
ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｌｅａｄｓ ｔｏ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．Ｔｈｅ
ｐｒｏｃｅｓｓ ｗａｓ ｔｅｒｍｅｄ ａｎｏｉｋｉｓ．Ａｎｏｉｋｉｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｓ ｃｒｕｃｉａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ａｎｄ
ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒｓ．Ｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｅａｔｕｒｅ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ，ａｎｏｉｋｉｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｈｏｕｌｄ ｐｌａｙ
６．５ ｍｍｏｌ／ｌ
３－ＭＡ抑制胰腺癌细胞株的迁移能力：
１）Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室检测胰腺癌细胞迁移能力：ＳＷｌ９９０悬浮培养２４ｈ处理
ＩＶ
组每４００×视野平均穿膜细胞数为：２５．１３＋３．７９；对照组为：８１．３４－３．８６；贴壁对 照组为：３．２３：ｋ－０．９６；贴壁处理组为：１．２７士ｏ．４５，Ｐ＝０．０００，组间有差异。 ２）ＴｒａｎｓｗｅＵ小室检测胰腺癌细胞迁移能力：ＰＡＮＣ １悬浮培养２４ｈ处理组 每４００×视野平均穿膜细胞数为：２６．８７＋３．４５；对照组为：６７．４０－ａ：９．３５；贴壁处 理组为：２６．１７＋２．１４；对照组为：６９．７３４－１．２１，Ｐ－－０．０００，组间有差异。 ７．胰腺癌细胞株存在自噬现象。 １）免疫荧光法标记ＭＡＰ！．ＬＣ３蛋白，胰腺癌细胞系ＳＷｌ９９０、ＰＡＮＣｌ贴壁 对照组、悬浮培养处理组（５ 组均为阳性。 ２）透射电镜－ＳＷ １９９０悬浮处理组（２０ ｍｍｏｌ／１ ３－ＭＡ）平均每个细胞可见自噬 体３．００＋１．００个：对照组可见自噬体７．４０５：４．８６个，Ｐ＝０．１５８，组间无差异。ＰＡＮＣＩ 悬浮处理组（２０ ｍｍｏｌ／ｌ ３－ＭＡ）平均每个细胞可见自噬体３．３３４－２．５２个；对照组 平均每个细胞可见自噬体４．００－Ｊ：２．８３个，Ｐ＝０．７４９。
ｍｍｏｌ／！，１０ ｍｍｏｌ／ｌ，２０ ｍｍｏｌ／Ｉ
３－ＭＡ）及悬浮对照
结论：
１．与永生化胰腺导管上皮细胞相比，胰腺癌细胞具有较强的抵抗失巢凋亡 能力。 ２．胰腺癌细胞株在正常贴壁培养、悬浮处理组、悬浮对照组均存在自噬活 性。 ３．３－ＭＡ可抑制胰腺癌细胞系ＳＷｌ９９０、ＰＡＮＣｌ细胞增殖和迁移并能显著 提高ＳＷＩ ９９０失巢凋亡率，其可能通过抑制与自噬有关的Ｐ１３Ｋ／ＡＫＴ途径。
５、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩ染色流式细胞技术检测失巢凋亡率。
６、透射电镜观察自噬体及免疫荧光检测自噬特征性蛋白ＭＡＰ！．ＬＣ３来评估自 噬水平。 ７、ＷＳＴ－ＣＣＫ８了解悬浮培养下处理组及对照组细胞的增殖能力。 ８、细胞迁移试验：Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室了解悬浮培养下处理组及对照组细胞的迁移 能力。
统计学方法：
研究目的
通过软琼脂培养法及ｐｏｌｙ—ＨＥＭＡ悬浮培养法模拟胰腺癌细胞失巢状态，并使 用自噬抑制剂３．甲基腺嘌呤（３．ＭＡ）抑制细胞自噬水平，检测凋亡率、细胞增殖、 迁移能力，观察自噬在胰腺癌细胞抵抗失巢凋亡中的作用及其对增殖、迁移的影
晌，从而开辟遏制胰腺癌抵抗失巢凋亡能力的新途径，为防治胰腺癌转移寻找新
ａｎ
ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐａｒｔ ｉｎ ｉｔ．Ｂｅｓｉｄｅｓ，ａｎｏｔｈｅｒ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ ｎａｍｅｄ
ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｌｓｏ ａｔｔｒａｃｔｓ ｍｙ ｇｒｅａｔ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ｗｈｉｃｈ Ｗａｓ ｃｏｍｍｏｎ ａｎｄ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｏｍｅｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｓ
５．５ ｍｍｏｌ／Ｉ
３－ＭＡ能够抑制胰腺癌细胞株增殖：
１）ＷＳＴ－ＣＣＫ８法酶联免疫检测仪４５０ｎｍ、６３０ｎｍ双波长ＯＤ值ＳＷ １９９０悬 浮培养２４ｈ处理组为１．２５７４－０．１４１；对照组为１．９５９４－０．２８４；ｐ－ｑ）．００７。ＳＷｌ９９０
悬浮培养４８ｈ处理组为１．５７２４－０．１７３；对照组为２．０７７４－０．２０５；Ｐ－－－０．０３ ｌ，组间有
肿瘤转移是个多阶段的过程涉及基质降解肿瘤细胞游走浸润肿瘤细胞再黏附等过程当肿瘤细胞由于某个基因缺失突变或者某个凋亡信号通路的缺陷而具备了抵抗凋亡的能力则在其脱离原发灶进入血液或淋巴循环系统失去基质支持发生侵袭转移时即不发生失巢凋亡从而实现远处重定植形成转移灶的过程这个结论在卵巢癌口腔鳞癌肠癌肺癌等癌细胞体外培养实验都得到了证实
个；ＳＷｌ９９０处理组形成集落数为２．２５士２．６３个，对照组为８．５０－ａ：３．１１个；Ｈ６Ｃ７
Ｉｌｌ
两组均未见集落形成，Ｐ＝－０．００７，组间有差异。 ２．悬浮培养诱导胰腺癌细胞株凋亡，３－ＭＡ作用２４ｈ可增加失巢状态 ＳＷｌ９９０凋亡率： １）ＳＷ １ ９９０悬浮培养处理组（悬浮培养条件下以５ｍｍｏｌ／ｌ的３－ＭＡ作用２４ｈ） 凋亡率为：（１６．６０４－２．３６）％；悬浮培养对照组（单纯悬浮培养２４ｈ）为： （９．７０４－１．７６）％；贴壁培养处理组（贴壁培养条件下以５ｍｍｏｌ／！的３－ＭＡ作用２４ｈ） 为（５．１４＋２．４４）％：贴壁培养对照组（单纯贴壁培养２４ｈ）为（２．９４＋１．３５）％； Ｐ－－０．０００，组问具有统计学差异。 ２）ＰＡＮＣｉ悬浮培养处理组（悬浮培养条件下以５ｍｍｏｌ／Ｉ的３－ＭＡ作用２４ｈ） 凋亡率为：（１４．１４４－２．６９）％：悬浮培养对照组（单纯悬浮培养２４ｈ）为（１９．８０４－８．１１） ％；贴壁培养处理组（贴壁培养条件下以５ｍｍｏｌ／１的３－ＭＡ作用２４ｈ）为 （１４．１０４－２．５７）％；贴壁培养对照组（单纯贴壁培养２４ｈ）为（９．２０４－０．４９）％， 除悬浮对照组与贴壁对照组Ｐ－－０．０２８外余两组间比较无统计学差异。
同的途径Ｐ１３ＵＡＫＴ途径来增强自噬水平缓解代谢压力、维持细胞生存抵抗失
巢凋亡。 ３－ＭＡ（３．甲基腺嘌呤）是常见的自噬抑制剂，其为ＩＩＩ型Ｐ１３Ｋ（ｈＶｐｓ３４）的 抑制剂，能抑制胞浆型ＬＣ３ Ｉ向自噬体膜蛋白ＬＣ３ ＩＩ的转化从而抑制自噬的激 活。因此，本实验利用３－ＭＡ抑制自噬并通过研究胰腺癌细胞的凋亡率、增殖、 迁移了解自噬在其中发挥的作用。
关键词：自噬：失巢凋亡；胰腺癌；３－ＭＡ
Ｖ
Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ３－ＭＡ ｉｍｐａｉｒｓ ａｎｏｉｋｉｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ
ｃａｎｃｅｒ
ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｓｕｎ Ｙａｔ—ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ：Ｙａｎ－ｙａｎ ＺＨＵＡＮＧ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆ．Ｓｈｉ－ｎｅｎｇ ＺＨＡＮＧ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｂａｃｋｇｒｏｕ ｎｄ
Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ
ｃａｎｃｅｒ
ｉｓ ｏｎｅ ｏｆｔｈｅ ｌｅａｄｉｎｇ
ｃａｕＳｅｓ
ｏｆｃａｎｃｅｒ ｄｅａｔｈ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ
ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ５％ｏｆｃａｎｃｅｒ—ｒｅｌａｔｅｄ ｄｅａｔｈｓ ｉｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚｅｄ ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ．Ｒｅｃｅｎｔ ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｍｃｒｅａｓｍｇ・ Ｃｅｌｌ ｔｏ ｃｅｌｌ
的靶点。
材料和方法
实验材料： 胰腺癌细胞系ＰＡＮＣ ｌ、ＳＷｌ９９０为中山二院消化内科保存，永生化胰腺导管
ｎ
上皮细胞Ｈ６Ｃ７为由加拿大安大略癌症研究所惠赠；自噬抑制剂３－ＭＡ购自 Ｍｅｒｃｋ公司；ｐｏｌｙ—ＨＥＭＡ、羊抗兔一ＦＩＴＣ ｌｇＧ购自Ｓｉｇｍａ公司；ＬＣ３多克隆兔抗 入抗体购自Ａｂｅａｍ公司，低熔点琼脂糖购自Ａｍｅｒｓｅｏ公司。
差异。 ２）ＷＳＴ－ＣＣＫ８法酶联免疫检测仪４５０ｎｍ、６３０ｎｍ双波长ＯＤ值ＰＡＮＣ Ｉ悬 浮培养２４ｈ处理组ＯＤ值为１．４６１４－０．０８５；对照组为２．０２４４－０．０５８；Ｐ－－０．０００。ＰＡＮＣｌ 悬浮培养４８ｈ处理组为１．７０２４－０．０４０；对照组为２．１６１４－０．１００；Ｐ＝０．００１，组间有 差异。
肠癌、肺癌等癌细胞体外培养实验都得到了证实。基于胰腺癌恶性程度高及早期 转移、易复发的特点，我们推测其可能具备较强的抵抗失巢凋亡的能力。 自噬（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）是细胞利用溶酶体降解自身大分子物质和受损的细胞器的 生物学过程，它是细胞维持自稳、保证生存的重要方法之一，尤其是细胞在面临 缺氧、营养供应不足、生长因子缺乏等不利条件时，其往往通过增加自噬活性 来保证细胞的生存。根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同可分为：大自 噬、小自噬及分子伴侣介导的自噬。正常上皮细胞具有基础水平的自噬，且自 噬与感染免疫、肿瘤耐药等也有关。研究表明，多个基因及信号途径参与自噬作 用，包括ＰＴＥＮ基因、Ｂｅｃｌｉｎｌ基因、内质网应激、Ｐ１３Ｋ／ＡＫＴ途径、 ＲＡＳ．ＲＡＦ．１．ＭＥＫ．ＥＲＫｌ／２途径等，其中Ｐ１３Ｋ／ＡＫＴ是参与失巢凋亡的一个重 要途径，因此推测，当细胞处于失巢的不良环境时，细胞可以通过作用彼此共
３－ＭＡ抑制自噬在胰腺癌细胞抵抗失巢凋亡中的作用
中山大学附属孙逸仙纪念医院消化内科 学位申请人：庄燕妍 导师：张世能教授
摘 研究背景
要
胰腺癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）是一种常见的消化道恶性肿瘤，其恶性程度高， 疾病进展快，早期转移率高，中位生存期短，５年生存率不超过５％，死亡率接近 发病率，预后恶劣。由于胰腺癌发病的隐蔽性，缺乏早期的临床表现及症状的非 特异性，因此确诊时往往已属晚期，丧失根治性手术的机会，即使是早期诊断并 行了根治手术的病人，长期生存率仍低于１５％，且存在术后容易复发的问题。大 部分临床患者仅能行姑息手术结合术后辅助化疗或者直接放化疗，不幸的是，胰 腺癌对放化疗并不敏感。胰腺癌预后差、容易复发的主要原因正是其早期转移率 高，因此，防治胰腺癌转移是关键。 正常上皮细胞具有黏附依赖性，失去细胞问或细胞与基质接触将导致细胞程 序性死亡，即失巢凋ｌ＝（ａｎｏｉｋｉｓ）。失巢凋亡被认为普遍参与机体发生、发育、更 新及退化的全过程，例如体内的各种空腔组织如肠管等的形成，此外还可防止脱 落的细胞种植并生长于其他不适宜的地方，对于维护组织内环境稳定和结构完整 具有重要意义。但当这种生理诱导机制发生异常则会导致疾病病理过程的发生， 如目前认为失巢凋亡也参与心血管疾病及某些皮肤疾病的发生。而其在肿瘤侵袭 转移过程中的关键作用是目前研究的热点之一。目前认为，肿瘤细胞尤其是恶性 程度高的肿瘤细胞具备抵抗失巢凋亡的能力。肿瘤转移是个多阶段的过程，涉及 基质降解、肿瘤细胞游走浸润、肿瘤细胞再黏附等过程，当肿瘤细胞由于某个基 因缺失、突变或者某个凋亡信号通路的缺陷而具备了抵抗凋亡的能力，则在其脱 离原发灶进入血液或淋巴循环系统，失去基质支持，发生侵袭转移时即不发生失 巢凋亡，从而实现远处重定植形成转移灶的过程，这个结论在卵巢癌、口腔鳞癌、
数据以均数４－标准差表示，两组均数间比较采用ｔ检验，多组均数间比较采 用单因素方差分析。应用ＳＰＳＳ 著性差异水平为Ｐ＜０．０５。
１ ３．０ ｆｏｒ
ｗｉｎｄｏｗｓ统计软件进行统计学处理，显
结果：
１．胰腺癌细胞具有抵抗失巢凋亡的能力：胰腺癌细胞ＰＡＮＣｌ在软琼脂培养 ２周后处理组（５
ｍｍｏｉ／Ｉ
３－ＭＡ）形成集落数为７．００４－２．６５个，对照组为１３．５０士６．６０
实验方法和分组： ｌ、细胞培养 胰腺癌细胞株ＰＡＮＣｌ、ＳＷｌ９９０：常规培养在含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ．１６４０ 培养基。 永生化胰腺导管上皮细胞Ｈ６Ｃ７：常规培养在ＫＳＦＭ培养基。 ２、实验分组：Ｉ：悬浮处理组（５ｍｍｏｌ／ｌ，１０ｍｍｏｌ／ｌ，２０ｍｍｏｌ／Ｉ ３－ＭＡ）２：悬浮对 照组３：贴壁处理组４：贴壁对照组。 ３、软琼脂培养基培养法观察处理组及对照组的集落形成情况。 ４、Ｐｏｌｙ—ＨＥＭＡ悬浮培养法诱导失巢凋亡。
３．５ ｍｍｏｌ／１
３－ＭＡ对ＳＷｌ９９０凋亡率的影响呈时间依赖性：悬浮培养会诱
导ＳＷｌ９９０细胞凋亡，随时间延长呈上升趋势；悬浮处理组３－ＭＡ作用１２ｈ及 ２４ｈ皆较对照组失巢凋亡率增加。 ４．３－ＭＡ作用２４ｈ对胰腺癌细胞株ＳＷｌ９９０凋亡的影响呈剂量依赖性：随
着３－ＭＡ浓度的提高，凋亡率呈现上升趋势。
ｏｒ ｃａｎｃｅｒ
ｉｓ
Ｃｅｌｌ ｔｏ ｍａｔｒｉｘ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｈａｖｅ
ｍａｊｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ
ｕｐｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖｌ
ｃｅｌｌｓ，ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ
ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｌｅａｄｓ ｔｏ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．Ｔｈｅ
ｐｒｏｃｅｓｓ ｗａｓ ｔｅｒｍｅｄ ａｎｏｉｋｉｓ．Ａｎｏｉｋｉｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｓ ｃｒｕｃｉａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ａｎｄ
ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒｓ．Ｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｅａｔｕｒｅ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ，ａｎｏｉｋｉｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｈｏｕｌｄ ｐｌａｙ
６．５ ｍｍｏｌ／ｌ
３－ＭＡ抑制胰腺癌细胞株的迁移能力：
１）Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室检测胰腺癌细胞迁移能力：ＳＷｌ９９０悬浮培养２４ｈ处理
ＩＶ
组每４００×视野平均穿膜细胞数为：２５．１３＋３．７９；对照组为：８１．３４－３．８６；贴壁对 照组为：３．２３：ｋ－０．９６；贴壁处理组为：１．２７士ｏ．４５，Ｐ＝０．０００，组间有差异。 ２）ＴｒａｎｓｗｅＵ小室检测胰腺癌细胞迁移能力：ＰＡＮＣ １悬浮培养２４ｈ处理组 每４００×视野平均穿膜细胞数为：２６．８７＋３．４５；对照组为：６７．４０－ａ：９．３５；贴壁处 理组为：２６．１７＋２．１４；对照组为：６９．７３４－１．２１，Ｐ－－０．０００，组间有差异。 ７．胰腺癌细胞株存在自噬现象。 １）免疫荧光法标记ＭＡＰ！．ＬＣ３蛋白，胰腺癌细胞系ＳＷｌ９９０、ＰＡＮＣｌ贴壁 对照组、悬浮培养处理组（５ 组均为阳性。 ２）透射电镜－ＳＷ １９９０悬浮处理组（２０ ｍｍｏｌ／１ ３－ＭＡ）平均每个细胞可见自噬 体３．００＋１．００个：对照组可见自噬体７．４０５：４．８６个，Ｐ＝０．１５８，组间无差异。ＰＡＮＣＩ 悬浮处理组（２０ ｍｍｏｌ／ｌ ３－ＭＡ）平均每个细胞可见自噬体３．３３４－２．５２个；对照组 平均每个细胞可见自噬体４．００－Ｊ：２．８３个，Ｐ＝０．７４９。
ｍｍｏｌ／！，１０ ｍｍｏｌ／ｌ，２０ ｍｍｏｌ／Ｉ
３－ＭＡ）及悬浮对照
结论：
１．与永生化胰腺导管上皮细胞相比，胰腺癌细胞具有较强的抵抗失巢凋亡 能力。 ２．胰腺癌细胞株在正常贴壁培养、悬浮处理组、悬浮对照组均存在自噬活 性。 ３．３－ＭＡ可抑制胰腺癌细胞系ＳＷｌ９９０、ＰＡＮＣｌ细胞增殖和迁移并能显著 提高ＳＷＩ ９９０失巢凋亡率，其可能通过抑制与自噬有关的Ｐ１３Ｋ／ＡＫＴ途径。
５、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩ染色流式细胞技术检测失巢凋亡率。
６、透射电镜观察自噬体及免疫荧光检测自噬特征性蛋白ＭＡＰ！．ＬＣ３来评估自 噬水平。 ７、ＷＳＴ－ＣＣＫ８了解悬浮培养下处理组及对照组细胞的增殖能力。 ８、细胞迁移试验：Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室了解悬浮培养下处理组及对照组细胞的迁移 能力。
统计学方法：
研究目的
通过软琼脂培养法及ｐｏｌｙ—ＨＥＭＡ悬浮培养法模拟胰腺癌细胞失巢状态，并使 用自噬抑制剂３．甲基腺嘌呤（３．ＭＡ）抑制细胞自噬水平，检测凋亡率、细胞增殖、 迁移能力，观察自噬在胰腺癌细胞抵抗失巢凋亡中的作用及其对增殖、迁移的影
晌，从而开辟遏制胰腺癌抵抗失巢凋亡能力的新途径，为防治胰腺癌转移寻找新
ａｎ
ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐａｒｔ ｉｎ ｉｔ．Ｂｅｓｉｄｅｓ，ａｎｏｔｈｅｒ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ ｎａｍｅｄ
ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｌｓｏ ａｔｔｒａｃｔｓ ｍｙ ｇｒｅａｔ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ｗｈｉｃｈ Ｗａｓ ｃｏｍｍｏｎ ａｎｄ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｏｍｅｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｓ
５．５ ｍｍｏｌ／Ｉ
３－ＭＡ能够抑制胰腺癌细胞株增殖：
１）ＷＳＴ－ＣＣＫ８法酶联免疫检测仪４５０ｎｍ、６３０ｎｍ双波长ＯＤ值ＳＷ １９９０悬 浮培养２４ｈ处理组为１．２５７４－０．１４１；对照组为１．９５９４－０．２８４；ｐ－ｑ）．００７。ＳＷｌ９９０
悬浮培养４８ｈ处理组为１．５７２４－０．１７３；对照组为２．０７７４－０．２０５；Ｐ－－－０．０３ ｌ，组间有
肿瘤转移是个多阶段的过程涉及基质降解肿瘤细胞游走浸润肿瘤细胞再黏附等过程当肿瘤细胞由于某个基因缺失突变或者某个凋亡信号通路的缺陷而具备了抵抗凋亡的能力则在其脱离原发灶进入血液或淋巴循环系统失去基质支持发生侵袭转移时即不发生失巢凋亡从而实现远处重定植形成转移灶的过程这个结论在卵巢癌口腔鳞癌肠癌肺癌等癌细胞体外培养实验都得到了证实
个；ＳＷｌ９９０处理组形成集落数为２．２５士２．６３个，对照组为８．５０－ａ：３．１１个；Ｈ６Ｃ７
Ｉｌｌ
两组均未见集落形成，Ｐ＝－０．００７，组间有差异。 ２．悬浮培养诱导胰腺癌细胞株凋亡，３－ＭＡ作用２４ｈ可增加失巢状态 ＳＷｌ９９０凋亡率： １）ＳＷ １ ９９０悬浮培养处理组（悬浮培养条件下以５ｍｍｏｌ／ｌ的３－ＭＡ作用２４ｈ） 凋亡率为：（１６．６０４－２．３６）％；悬浮培养对照组（单纯悬浮培养２４ｈ）为： （９．７０４－１．７６）％；贴壁培养处理组（贴壁培养条件下以５ｍｍｏｌ／！的３－ＭＡ作用２４ｈ） 为（５．１４＋２．４４）％：贴壁培养对照组（单纯贴壁培养２４ｈ）为（２．９４＋１．３５）％； Ｐ－－０．０００，组问具有统计学差异。 ２）ＰＡＮＣｉ悬浮培养处理组（悬浮培养条件下以５ｍｍｏｌ／Ｉ的３－ＭＡ作用２４ｈ） 凋亡率为：（１４．１４４－２．６９）％：悬浮培养对照组（单纯悬浮培养２４ｈ）为（１９．８０４－８．１１） ％；贴壁培养处理组（贴壁培养条件下以５ｍｍｏｌ／１的３－ＭＡ作用２４ｈ）为 （１４．１０４－２．５７）％；贴壁培养对照组（单纯贴壁培养２４ｈ）为（９．２０４－０．４９）％， 除悬浮对照组与贴壁对照组Ｐ－－０．０２８外余两组间比较无统计学差异。
同的途径Ｐ１３ＵＡＫＴ途径来增强自噬水平缓解代谢压力、维持细胞生存抵抗失
巢凋亡。 ３－ＭＡ（３．甲基腺嘌呤）是常见的自噬抑制剂，其为ＩＩＩ型Ｐ１３Ｋ（ｈＶｐｓ３４）的 抑制剂，能抑制胞浆型ＬＣ３ Ｉ向自噬体膜蛋白ＬＣ３ ＩＩ的转化从而抑制自噬的激 活。因此，本实验利用３－ＭＡ抑制自噬并通过研究胰腺癌细胞的凋亡率、增殖、 迁移了解自噬在其中发挥的作用。
关键词：自噬：失巢凋亡；胰腺癌；３－ＭＡ
Ｖ
Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ３－ＭＡ ｉｍｐａｉｒｓ ａｎｏｉｋｉｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ
ｃａｎｃｅｒ
ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｓｕｎ Ｙａｔ—ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ：Ｙａｎ－ｙａｎ ＺＨＵＡＮＧ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆ．Ｓｈｉ－ｎｅｎｇ ＺＨＡＮＧ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｂａｃｋｇｒｏｕ ｎｄ
Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ
ｃａｎｃｅｒ
ｉｓ ｏｎｅ ｏｆｔｈｅ ｌｅａｄｉｎｇ
ｃａｕＳｅｓ
ｏｆｃａｎｃｅｒ ｄｅａｔｈ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ
ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ５％ｏｆｃａｎｃｅｒ—ｒｅｌａｔｅｄ ｄｅａｔｈｓ ｉｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚｅｄ ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ．Ｒｅｃｅｎｔ ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｍｃｒｅａｓｍｇ・ Ｃｅｌｌ ｔｏ ｃｅｌｌ
的靶点。
材料和方法
实验材料： 胰腺癌细胞系ＰＡＮＣ ｌ、ＳＷｌ９９０为中山二院消化内科保存，永生化胰腺导管
ｎ
上皮细胞Ｈ６Ｃ７为由加拿大安大略癌症研究所惠赠；自噬抑制剂３－ＭＡ购自 Ｍｅｒｃｋ公司；ｐｏｌｙ—ＨＥＭＡ、羊抗兔一ＦＩＴＣ ｌｇＧ购自Ｓｉｇｍａ公司；ＬＣ３多克隆兔抗 入抗体购自Ａｂｅａｍ公司，低熔点琼脂糖购自Ａｍｅｒｓｅｏ公司。
差异。 ２）ＷＳＴ－ＣＣＫ８法酶联免疫检测仪４５０ｎｍ、６３０ｎｍ双波长ＯＤ值ＰＡＮＣ Ｉ悬 浮培养２４ｈ处理组ＯＤ值为１．４６１４－０．０８５；对照组为２．０２４４－０．０５８；Ｐ－－０．０００。ＰＡＮＣｌ 悬浮培养４８ｈ处理组为１．７０２４－０．０４０；对照组为２．１６１４－０．１００；Ｐ＝０．００１，组间有 差异。
肠癌、肺癌等癌细胞体外培养实验都得到了证实。基于胰腺癌恶性程度高及早期 转移、易复发的特点，我们推测其可能具备较强的抵抗失巢凋亡的能力。 自噬（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）是细胞利用溶酶体降解自身大分子物质和受损的细胞器的 生物学过程，它是细胞维持自稳、保证生存的重要方法之一，尤其是细胞在面临 缺氧、营养供应不足、生长因子缺乏等不利条件时，其往往通过增加自噬活性 来保证细胞的生存。根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同可分为：大自 噬、小自噬及分子伴侣介导的自噬。正常上皮细胞具有基础水平的自噬，且自 噬与感染免疫、肿瘤耐药等也有关。研究表明，多个基因及信号途径参与自噬作 用，包括ＰＴＥＮ基因、Ｂｅｃｌｉｎｌ基因、内质网应激、Ｐ１３Ｋ／ＡＫＴ途径、 ＲＡＳ．ＲＡＦ．１．ＭＥＫ．ＥＲＫｌ／２途径等，其中Ｐ１３Ｋ／ＡＫＴ是参与失巢凋亡的一个重 要途径，因此推测，当细胞处于失巢的不良环境时，细胞可以通过作用彼此共