重组体克隆的筛选和鉴定
重组子的筛选和鉴定
重组子的筛选和鉴定
重组子可通过酶切进行鉴定，也可以利用扩增引物通过PCR 进行鉴定，阳性重组子能切出所需要的片段或得到相应片段的PCR 产物。
1. 用牙签挑取平板上的菌落接种于2ml 含适当抗生素的LB 培养基中，37℃摇床培养过夜。
2. 次日取菌液0.2-0.5ml，12,000rpm×3min 离心，弃上清，加入20μl ddH2O 和20μl 酚/ 氯仿，震荡混匀，12,000rpm×5min 离心。
3. 取上清进行琼脂糖电泳，加入载体质粒DNA 作为阴性对照，根据质粒大小初步筛选重组子，重组子的泳动速度应该慢于载体质粒。
4. 用碱法小量制备可能是重组子的质粒DNA。
5. 选取适当的酶，对重组子进行酶切分析，酶切体积均为10μl 体系。
酶切样品进行琼脂糖电泳鉴定是否有所需片段。
6. 酶切分析正确的重组子分成两份，一份进行测序反应，另外一份保种。
7. 若用PCR 法鉴定，则在第 2 步时每个样本取0.5-1.0μl 菌液为模板进行PCR 反应，每管反应体系最低可少至10μl ，PCR 产物电泳，能得到所需条带的样本进一步提取质粒酶切鉴定或送样品测序。
重组克隆的筛选和鉴定
1unit 0.5 umol/L
0.3 0.5 7.7
1.8 3 46.2
一、载体遗传标记法
——-半乳糖苷酶显色反应选择法
原理：
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的 片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因 （ 片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能 的-半乳糖苷酶。
选择过程：
重组子因LacZ’基因的插入灭活而呈白色，非重组子则显蓝色
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
重组克隆筛选
凝胶电泳检测法质粒DNA的电泳 Nhomakorabea移率与其分子量大小成比例，带有 外源 DNA 插入序列重组体 DNA 比不具有外源 DNA 插入序
列的分子量较大，在凝胶中的迁移速度要缓慢些。
重组克隆的筛选和鉴定
原理
载体遗传标记法
1.抗药性筛选法 2.营养缺陷型筛选法 3. -半乳糖苷酶显色反应选 择法
其它方法
1.凝胶电泳检测法 2.PCR法
引言
转化子（接纳载体或重组分子的转化细胞）与 非转化子（接纳载体或重组分子的转化细胞）； 重组子（含有DNA重组分子的转化子）与非重 组子（仅含有空载载体分子的转化子）； 期望重组子（含有目的基因的重组子）与非期 望子（不含目的基因的重组子）
PCR法
利用合适的引物，以提取的质粒为模板进行PCR反应， 通过对PCR产物的电泳分析来确定目的基因是否重组入载 体中。
重组克隆筛选
PCR法的改进与优化
（1）以转化的单菌落为模板,通过PCR挑取 重组子克隆 ； （2）将待筛选的重组克隆重新进行液体培 养，而后进行PCR ；
实验八 重组克隆筛选(酶切鉴定)
实验八重组克隆筛选（酶切鉴定）【实验目的】1.掌握质粒提取的基本方法的原理；2.学习和掌握限制性内切酶的使用方法。
【实验原理】重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。
不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。
从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。
常用的筛选方法有两类。
一类是针对遗传表型改变筛选法，以－半乳糖苷酶系统筛选法为代表。
另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交等方法。
1．－半乳糖苷酶系统筛选法（蓝白斑筛选法）使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。
这些载体的共同特征是载体上携带一段细菌的基因lacZ。
lacZ编码－半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的肽，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15基因型。
重组子由于外源片断的插入使肽基因失活不能形成互补作用，也就是说，宿主细胞表现为－半乳糖苷酶失活。
因此，在X-gal平板上，重组克隆为无色噬菌斑或菌落，非重组克隆为蓝色噬菌斑或菌落。
这种筛选方法操作简单，但当插入片断较短（小于500bp），且插入片断没有影响lacZ基因的读框时，有假阴性结果的出现。
2．快速裂解菌落鉴定质粒大小从平板中挑取菌落，过夜培养后裂解，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较，根据迁移率的减小初步判断是否有插入片断存在。
本方法适用于插入片断较大的重组子的初步筛选。
3．限制酶图谱鉴定对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割重组子释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。
4．Southern 印迹杂交为确定DNA插入片断的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern 印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片断作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片断是否是所需的靶基因片断。
基因工程重组体克隆的筛选和鉴定
基因功能的正向遗传筛选技术
突变体库的构建
通过化学诱变、同源重组 等技术构建大规模突变体 库。
表型筛选
通过特定表型筛选出具有 特定功能的突变体。
突变基因的鉴定
通过测序等技术鉴定出突 变基因，并研究其功能。
05
克隆基因的应用前景
克隆基因在医学上的应用
疾病诊断与治疗
利用克隆技术获取特定基因，可用于疾病诊断、药物研发和个性化治疗。
基因敲入
将特定基因敲入生物体基因组，观察 生物体表型变化，以确定该基因的功 能。
基因表达干扰
通过转录因子或RNAi技术干扰特定 基因的表达，观察生物体表型变化， 以确定该基因的功能。
正向遗传筛选
通过突变体库筛选具有特定表型的突 变体，鉴定突变基因，以研究该基因 的功能。
基因敲除和敲入技术
基因敲除技术
基于测序的筛选
对转化子进行全基因组测序或目的基因片段测序，与已知序列进行比 对，判断是否含有目的基因。
蓝白筛选法
原理
步骤
利用载体上标记基因的表达产物对转化子 进行筛选，通过菌落颜色的变化判断是否 含有目的基因。
将转化子涂布在含有抗生素的培养基上， 培养后观察菌落颜色变化，蓝色菌落为阳 性克隆，白色菌落为阴性克隆。
基因表达的蛋白质印迹分析
原理
利用特异性抗体检测样品中特定蛋白质的表达情况，通过显 色反应或荧光信号对蛋白质进行定性或定量分析。
用等 方面的研究。
04
克隆基因的功能研究
基因功能研究的方法
基因敲除
通过基因工程技术将特定基因敲除， 观察生物体表型变化，以确定该基因 的功能。
Northern印迹杂交
原理
基于RNA的电泳分离和转移，将RNA 片段与标记的探针进行杂交，以检测 特异的RNA转录本。
基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
重组子的筛选方法
重组子的筛选方法一、引言重组子筛选是基因工程中的一项关键技术，用于识别和分离含有目的基因的克隆。
随着生物技术的不断发展，重组子筛选方法也日益多样化，为研究者提供了更多选择。
本文将对几种常见的重组子筛选方法进行详细介绍，并比较其优缺点。
二、常见重组子筛选方法1. 蓝白筛选法：蓝白筛选法是一种基于λ噬菌体载体和lacZ基因的筛选方法。
其基本原理是利用lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶可以将无色底物X-gal转化为蓝色产物。
当载体上含有目的基因时，lacZ基因被破坏，无法产生β-半乳糖苷酶，菌落呈白色。
这种方法操作简便，适用于大量筛选。
2. 抗性筛选法：抗性筛选法是利用标记基因赋予宿主菌抗药性或营养缺陷型特性，从而筛选重组子的方法。
例如，利用卡那霉素抗性基因（neo）对细菌进行筛选。
当载体上含有目的基因时，neo基因被破坏，重组子对卡那霉素产生抗性。
这种方法成本低廉，适用于实验室条件。
3. 荧光标记筛选法：荧光标记筛选法是利用荧光标记探针与目的基因杂交，通过荧光显微镜观察荧光信号来筛选重组子的方法。
该方法灵敏度高，可实现自动化操作。
然而，荧光标记探针制备成本较高，且对实验操作要求较高。
4. 测序法：测序法是通过对目的基因进行测序，比对已知序列来确定重组子的方法。
该方法准确度高，适用于所有基因型重组子的筛选。
然而，测序法成本较高，操作复杂，不适合大量筛选。
三、比较与讨论蓝白筛选法、抗性筛选法和荧光标记筛选法各有优缺点。
蓝白筛选法操作简便、成本低廉，适用于大量筛选；但灵敏度较低，可能会漏掉一些弱阳性克隆。
抗性筛选法成本低、适用范围广；但标记基因可能会影响目的基因的表达，导致结果不准确。
荧光标记筛选法灵敏度高、可自动化操作；但成本较高，对实验操作要求严格。
测序法则准确度高，可适用于所有基因型重组子的筛选；但成本较高、操作复杂，不适合大量筛选。
因此，在选择重组子筛选方法时，应根据具体实验需求和条件进行综合考虑。
实验17-重组体筛选与鉴定
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
液。
6.感受态细胞分装成200μl的小份,暂且不用的贮存于-70℃可
保存半年。 取其中一份进行转化。
7. 向转化管中加入DNA（不超过10ul）,轻度摇晃混合后于冰上
放置30分钟。
8. 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90秒
(不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰浴，冷却1－2分钟。
重组体筛选与鉴定
重组质粒的转化
转化（transformation)：
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞 获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研 究领域的基本实验技术。
转化方法
1、化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl） 制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA 分子导入受体细胞；
不同抗生素基因筛选 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉 素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在 选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化 体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如 果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基 平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确 认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含 有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上 生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不 能确定哪个克隆含有插入片段。
受体菌：his外源基因：his+
基因克隆实验流程
基因克隆实验流程基因克隆技术，又称重组 DNA 技术，是将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA 进行体外重组，获得新的重组DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白，以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。
一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。
获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。
该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。
原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。
2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。
此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。
因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。
3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。
在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。
4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。
用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。
用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。
二、选择适当的载体按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。
为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。
第六章重组体的筛选与鉴定
一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应
1.以 1.以pBR322质粒为例 质粒为例
（1）pBR322质粒的一般特性 质粒的一般特性 在pBR322质粒上有两个抗生素基因，Ampr基因内有 pBR322质粒上有两个抗生素基因， 质粒上有两个抗生素基因 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点， PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 BamHⅠ 两种限制性核酸内切酶单一 位点。 位点。
如下图所示
一、根据载体表特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法
Ampr pBR322 Tetr AmprTetr
菌落原位影印
pBR322
+
pBR322
AmprTets
Amp琼脂平板 琼脂平板
Tet琼脂平板 琼脂平板
图 应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法 1.乳糖操纵子的结构 1.乳糖操纵子的结构
二、根据插入基因遗传性状的筛选 (一)原理 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后, DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后,如果 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 达,而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 互补 (二)举例 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时,将该基因 亮氨酸的基因 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用 能利用表达产物亮 少亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用表达产物亮 氨酸的细菌才能生长 因此,获得的转化子都是重组子 生长, 转化子都是重组子. 氨酸的细菌才能生长,因此,获得的转化子都是重组子.
第七章 重组体克隆的筛选和鉴定
第一节 利用遗传标记的表型特征筛选
利用载体上的携带的选择性标记基因筛选转化子或重组子
一、抗药性筛选法 1. 原理： 原理： 载体上携带有受体细胞敏感的抗生素抗性 基因。
质粒上有两个抗菌素性基因: 如：pBR322质粒上有两个抗菌素性基因 质粒上有两个抗菌素性基因 Tetr和Ampr。
选择过程： 3. 选择过程： （1）四环素抗性插入失活 ） 如果在Tet 上插入外源DNA，导致四 如果在 r上插入外源 ， 环素抗性基因失活，可用四环素加环 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 平板培养基选择重组克隆 Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 失活的菌生长被四环素抑制， 丝氨酸杀死，保留下来； 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。 反而被环丝氨酸杀死。
最好用单克隆抗体（ 最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）。 ）。
blotting） 四、免疫印迹（western blotting）法 免疫印迹（ 在蛋白质凝胶电泳以后， 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方 法检测胶上的蛋白质泳带。 法检测胶上的蛋白质泳带。 1.原理： 1.原理： 原理 （1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 ） 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）： ）： ① SDS: 是蛋白质的变性剂， 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的 蛋白质维持线性状态， 蛋白质维持线性状态，并与蛋白质 结合，使蛋白质带上负电荷。 结合，使蛋白质带上负电荷。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
基因工程-第8章-重组子的筛选与鉴定
2、根据插入序列的表型特征选择重
组体分子的直接选择法
转化进来的外源DNA编码的基因，能够 对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变体发 生体内抑制或互补效应，从而使被转化 的寄主细胞表现出外源基因编码的表型 特征。
Example:
λ gt.λ B噬菌体（由于C片断的缺失而造成重 组缺陷的λ red－噬菌体），在大肠杆菌lig ts菌株上生长不能形成噬菌斑，在有连接酶功 能的大肠杆菌lig＋菌株上形成噬菌斑。 将具有连接酶基因的重组体噬菌体λ gt. λ B，涂布在大肠杆菌lig ts菌株上时，通过 寄主细胞的互补作用，能够形成噬菌斑。根据 形成噬菌斑这种表型特征，直接选择具野生功 能的重组体噬菌体。
缺点： 不单要求克隆的DNA片断必须大到足 以包含一个完整的基因，而且还要求所 编码的基因能够在大肠杆菌中实现功能 表达。 （对于真核基因很难达到要求）
二、物理检测法
1、凝胶电泳检测法 从宿主细胞中提取重组子分子，利用凝胶 电泳的方法，鉴定外源片断是否插入及其 长度。 优点：简便、快速。 缺点：只能提供克隆片段大小的信息。
抗药性标记插入失活
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
Tc
有DNA插入
Amp r
Tcr
转化
Amp r Tc s
外源DNA
Amp r பைடு நூலகம்cr
无菌落 筛选重组子 阳性菌落
Amp r Tc s
提取DNA 电泳
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
Amp r Tc s
重组DNA
（2）β-半乳糖苷酶显色反应选择法
外源DNA 有DNA插入
Apr
转化
Ap r
Ap r
筛选重组子 白色菌落
重组体的筛选和鉴定
二、利用插入序列提供的表型特征筛选
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。 一、原理： 1.弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。 受体菌： his外源基因： his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
GFP 老鼠
GFP- Kac的狗
GFP Alba 發青綠光 芒的 兔子
①新霉素磷酸转移酶基因（NPTⅡ）抗新霉素、卡 那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选动 植物转化子的选择标记基因。 ②潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）赋予转化子能抗 潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物 转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。 ③氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）也被用于筛选动 植物转化子的标记基因。
PstI酶切
外源DNA 黏性末端 连接酶 PstI酶切
pBR322 4363
重组子(ampstetr) 空载体(amprtetr) 插入子(ampstets)
导 入
黏性末端
重组子转化子(ampstetr) 空载体转化子(amprtetr)
影印在含Ap的平板上
涂布在含Tc的平板上
野生型的E.coli (ampstets)
缺点：需要电镜！
2. Northern blotting
用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。 主要检测插入片 断是否被转录。 从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
Northern Blotting
Western Blotting
Southern和Western印迹法
32P-labled
重组子的筛选与鉴定
一、遗传学检测法
无环丝氨酸培养基
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 选择过程 （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基
因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 （2） 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有终止密码子；
（不破坏 肽）。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。
（只在特定条件下）。 1.原理 （1）弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型
缺陷。
受体菌： his
-
外源基因： his
+
阳性克隆才能在不 含组氨酸的培养基 中生长
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 1.原理
（2）增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例：小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二
优点：简便、快速，结果较可靠。
缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。 （一） 根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法
1. 抗药性标记插入失活选择法 2. β-半乳糖苷酶显色反应选择法 （二）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所 具有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表 现出外源基因编码的表型特征。
重组体的筛选和鉴定
1975年，英国Southern创建
针对DNA的杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探 针进行检测的方法。
原理：将重组菌的基因组或质粒DNA提取出来，经合适的限制
性内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分离，把定位在凝胶 中的DNA碱变性处理，使其双链DNA分开，再将凝胶中变性的 DNA转移到硝酸纤维素膜上，用制备的标记探针与其充分混合， 进行同源性DNA杂交。
为Tcr表型．而质粒为Tcs表型。
转化菌涂在Tc平板上，只有含有外源DNA插入片段
的阳性重组子的转化菌能生长成菌落。
16
（3）显色反应筛选：蓝白斑筛选
乳糖 -半乳糖苷酶 X-gal 半乳糖 + 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝 α-互补 深蓝色 （酶活）
半乳糖
β—半乳 糖苷酶
α链（lacZα） ：四聚体装配
A
T T
表型筛选加酶切筛选
T A A T
38
二、目的克隆的鉴定
（一）核酸分子杂交(nucleic acid hybridization) 原理
具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温 度和离子强度)可按碱基互补的原则退火形成双链.
杂交分子可在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合
18
19
20
pUC18/19
5’
lacZ’
EcoRI SacI
EcoRI SacI
KpnI SmalI BamHI XbaI SalI
pUC18
PstI
SphI Hind III
ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTG
克隆基因的筛选原理是什么
克隆基因的筛选原理是什么克隆基因的筛选原理是指通过人工手段从大量基因样本中筛选出具有特定功能的基因，并将其放入宿主细胞中进行进一步研究和应用。
克隆基因的筛选原理主要包括基因文库构建、基因识别和筛选、基因克隆和鉴定几个关键步骤。
基因文库构建是克隆基因筛选的第一步。
基因文库是将一个生物体的全基因组按照一定的方法嵌入到携带载体中，使得携带载体中每一个片段都代表原生的一部分基因组。
构建基因文库的关键在于获取高质量的DNA样本和选择合适的携带载体。
DNA样本可通过提取原生生物体中的基因组DNA获得，或者从cDNA 文库中选择目标基因进行片段化、并连接载体。
选取合适的携带载体要考虑到质粒大小、复制能力、选择标记以及宿主菌的特点等因素。
构建好的基因文库可进一步用于基因识别和筛选。
基因识别和筛选是克隆基因筛选的关键环节。
通过基因识别和筛选可以找到含有特定功能基因的片段。
常用的基因识别和筛选方法包括杂交筛选、PCR筛选、亚克隆筛选等。
杂交筛选是目前常用的筛选方法之一，它是利用目标DNA序列与抗原DNA进行互相杂交，然后用标记技术检测杂交融合的特定单链DNA。
PCR筛选是利用特异引物进行PCR扩增，通过扩增产物的特异性确认目标基因。
亚克隆筛选是通过对目标基因片段进行酶切、分离纯化、与载体连接等操作，用于提取目标基因并确认其准确性和特异性。
基因克隆是克隆基因筛选的核心步骤。
基因克隆是将目标基因提取出来，并与携带载体连接，将得到的重组载体导入宿主细胞中进行繁殖。
常用的基因克隆技术包括限制性内切酶切割、连接酶连接、DNA凝胶电泳纯化等。
限制性内切酶切割是将目标基因和携带载体通过限制性内切酶在特定位点进行酶切，然后通过连接酶将两者进行连接。
DNA凝胶电泳纯化是通过凝胶电泳将目标基因和携带载体分离，然后提取纯化后的DNA进行进一步实验。
基因鉴定是克隆基因筛选的最后一步。
通过基因鉴定可以确认克隆的基因是否与目标基因一致，并确定其序列和功能。
鉴定重组子的方法
鉴定重组子的方法
鉴定重组子的方法一般可分为以下几种：
1. PCR扩增法：通过聚合酶链式反应（PCR）在靶DNA序列的两端引入特定的引物，再通过PCR扩增得到重组子的DNA序列。
2. 限制性内切酶消化法：将待重组的DNA片段和载体DNA进行双酶切，然后通过连接酶将两者连接起来，最后通过转化到宿主细胞内进行复制和表达。
3. 嵌合PCR法：利用两对引物分别扩增待重组的DNA片段和载体DNA片段，两者的两端引物设计成互补序列，通过PCR扩增后，两个片段可通过重叠互补序列自行连接。
4. 策略引导融合法：通过引物设计，使待重组的DNA片段和载体DNA具有互补的序列，然后通过热变性和退火的方式使两者相互结合。
5. 基因组DNA文库筛选法：通过构建基因组DNA文库，然后通过探针的杂交和筛选，得到具有重组子的克隆。
以上是常见的鉴定重组子的方法，具体的选择可以根据实验需要和条件进行决定。
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缺点：需要电镜！
2. Northern blotting
用DNA（或RNA）探 针检测RNA样品。 主要检测插入片断
是否被转录。
从宿主细胞中提取RNA， 再用探针杂交。
第五节 免疫化学检测法
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交”
利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且 表达出相应的蛋白质的外源基因。
（3）环丝氨酸：
杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基 因失活，可用四环素+环丝氨酸平板培养基选
择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨
酸杀死，保留下来；
Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而
第七章 重组体克隆的筛选和鉴定
转化子与筛选的概念
转化子(transformant)：导入外源DNA后获得了新
的遗传标志的细菌细胞或其它受体细胞。
筛选(screening)：将重组体的转化子细胞或转染噬 菌体群体从其它细胞群体中分离出来，并要鉴定 无性繁殖的外源基因确实为目的基因的过程。
筛选方法的类型
2. 选择过程
-半乳糖苷酶使X-gal分解成兰色产物。
第二节 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。
（只在特定条件下）。
一、原理： 1.弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突 变型缺陷。
受体菌： his外源基因： his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
根据载体体系、宿主细胞的特性以及外源基因在
受体细胞表达情况的不同，分为：
1. 直接筛选 针对载体携带某种或某些选择标记基因（selectable marker genes）、报告基因（reporter gene）或目的 基因而设计的筛选方法。 特点：直接测定基因或基因类型
2. 间接筛选
不要直接鉴定基因，而是利用其它方式， 例如利用特异抗体与目的基因表达产物相 互作用，进行对重组体的筛选。
加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗
掉。二抗只识别一抗。
二抗
二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、 脲酶等）。
（4）显色反应
加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应
转变成有色物质（或发光）。
（5）比色 在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。
四、免疫印迹（western blotting）法
mRNA DNA
核糖体 小亚基
核糖体 大亚基
能翻译
不能翻译
2. 过程
四、杂交释放转译法
1. 原理：
在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的
mRNA杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的
mRNA，进行体外转录。
研究其转录产物的性质是否是预期的基因产
物（如分子量、免疫源性等）。
2. 过程
硝酸纤 载体和插 维素滤膜 入的cDNA
一抗 二抗 辣根过氧 化物酶 底物 产物， 并发出光
辣根过氧化物酶：HRPO
底片曝光
③ Blotting过程
1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。
2）洗去未结合的一抗。
3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 4）清洗掉未结合的二抗。 5）用HRPO的底物浸泡膜。 6）暗室里曝光，冲洗胶片。 Immuno Blotting
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测 胶上的蛋白质泳带。
1.原理： （1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）： ① SDS: 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性 状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： （Polyacrylamide gel electrophoresis）
不依赖于外界压力的一类基因。把它的编码序列 与目的基因融合表达后，可通过报告基因产物的 表达来“报告”目的基因的表达调控，是细胞和 组织内监测基因表达与蛋白定位的理想标记。
报告基因
β-葡萄糖醛酸糖苷酶(β-glucuronidase)基因 荧光素酶(luciferase)基因 氯霉素乙酰转移酶(chioramphenicol acetyltransferase)基因 β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)基因 胭脂碱合成酶(nopaline synthetase,nos)基因 章鱼碱合成酶(octopine synthetase,ocs)基因 乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthetase)基因 苏氨酸脱水酶(threonine dehydratase)基因 绿色荧光蛋白质(green fluorescent protein)基因
主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因。 它是重组DNA载体的重要标记，通常用来检验转化成功与 否 。 培养在含有抗菌素或除草剂的选择培养基上的非转化细胞， 便被杀死或是生长受到抑制，而转化细胞则能够存活下来， 得到正确选择和鉴定。
选择标记基因
a.抗菌素抗性基因：
新霉素(neomycin) 磷酸转移酶基因潮霉素(hygromycin)
与外源DNA插入片断互补的序列。 重组克隆与探针杂交。
3. 识别标记 （1）放射性同位素 （2）非放射性标记
32P 或 125I
。
荧光素
二、核酸杂交检测方法 1. Southern blotting
①用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。
②从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），
再用探针杂交。
③只有带有插入片断的重组载体才能与
一般克隆与筛选策略
第一节
载体表型选择法
第二节
第三节
根据插入基因的表型选择
DNA电泳检测法
第四节
第五节 第六节 第七节
核酸杂交检测法
免疫化学检测法 转译筛选法 几种常见的真核生物重要基因选择方法
第一节 载体表型选择法
一、抗药性标记及其插入失活选择法 1. 原理：
pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
125I
标记的二抗 结合蛋白
2. 放射性抗体检测法过程
二、免疫沉淀检测法
检测分泌型产物。
1. 原理 2. 方法 把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入 基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，
抗原——抗体凝集反应。
就会与抗体反应形成“沉淀圈”。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位 溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
被环丝氨酸杀死。
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗
性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
乳糖
-半乳糖苷酶
半乳糖 半乳糖
+ +
葡萄糖
X-gal
5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
1. 原理：
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z） 的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位 点。受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因 （ 片段缺失）。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功 能的-半乳糖苷酶。
三、PCR扩增检测法 1. 原理
PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。
2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。
（2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
第四节 核酸杂交检测法
一、原理： 1. 核酸杂交 2. 检测用的探针
在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝
胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于
其分子量大小（链的长短），从而把不同分子
量的肽链分开。
Da ③蛋白质电泳的分子量标准 已知分子量的蛋白质混合液。 氨基酸平均分子量：
110Da 道尔顿(质量单位, 等于一氧
原子质量的十六分之一。 一克约为6×1023道尔顿
凝胶放射自显影
总mRNA 杂交
cDNA编 码的蛋白
硝酸纤 载体和插 cDNA基因的 维素滤膜 入的cDNA mRNA
电泳 cDNA编 码的蛋白
洗脱
硝酸纤 载体和插 维素滤膜 入的cDNA
cDNA基因的 mRNA
体外翻译
收集
35S标记的氨基酸
第七节
植物转化体报道基因筛选法
选择基因，指可使被转化的细胞获得其亲本细胞所 不具备的新的遗传特性，从而使得人们能够使用 特定的选择培养基，将转化的新细胞从亲本细胞 群体中选择出来的一类特殊的基因。
④结果 单抗blotting 结果
多克隆抗体 Blotting的 结果
第六节 转译筛选法
借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载 体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。 一、无细胞翻译系统 能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。
如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。
二、转译筛选
一、放射性抗体检测法 1. 抗体与产物的结合方式
根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性 质可分为几种作用方式：
固相支 持滤膜 固相支 持滤膜 固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
一抗
待测基因 二抗 产物蛋白 一抗
125I
标记的二 抗结合蛋白
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。