紫外可见分光光度计线性范围的校准

紫外可见分光光度计线性范围的校准
黄彬磊;吴成新;孙凤;朱佳奇
【摘要】建立紫外可见分光光度计线性范围的校准方法.通过实验对紫外可见分光光度计线性范围的校准进行研究,提出了相应的校准方法和技术指标.采用重铬酸钾标准物质进行校准,测量波长为257 nm.线性范围下限不大于1.0×10-3 mg/mL,线性范围上限不小于0.10 mg/mL.该校准方法覆盖了JJG 178-2007《紫外、可见、近红外分光光度计检定规程》中没有覆盖的吸光度范围,能够实现紫外可见分光光度计全范围吸光度的计量校准.
【期刊名称】《化学分析计量》
【年(卷),期】2019(028)003
【总页数】4页(P107-110)
【关键词】紫外可见分光光度计;线性范围;校准;吸光度
【作者】黄彬磊;吴成新;孙凤;朱佳奇
【作者单位】上海市质量监督检验技术研究院,上海 201114;上海市质量监督检验技术研究院,上海 201114;上海市质量监督检验技术研究院,上海 201114;上海市质量监督检验技术研究院,上海 201114
【正文语种】中文
【中图分类】O657.32
1854年，杜包斯克(Duboscq)和奈斯勒(Nessler)首次将朗伯–比耳定律应用于定
量分析化学领域，由此诞生了第一台比色计。

1918年，美国国家标准局制造出了世界上第一台紫外可见分光光度计［1，2］。

时至今日，紫外可见分光光度计在
分光元器件、仪器控制模块、记录与绘图设备、检测器、仪器构型等方面已经历了多次更新换代［3］，仪器的性能不断提高，并且更加智能化、高速化、小型化。

虽然紫外可见分光光度计的应用已有近百年的历史，但是由于其具有灵敏度高、选择性好、操作简便、适用范围广等特点，因此仍然是目前应用最广泛的分析仪器之一［4］。

在化工［5，6］、食品［7，8］、生物医药［9，10］、环境监测［11，12］、第三方检测［13，14］等领域的分析实验室中都离不开紫外可见分光光度计。

对于紫外可见分光光度计的计量检定，国家有相应的检定规程JJG 178–2007
《紫外、可见、近红外分光光度计检定规程》［15］。

该检定规程所涉及透射比
的计量中，检定点为10%，20%，30%，按照朗伯–比耳定律换算成吸光度为
1.000，0.699，0.523三点，所覆盖的测量范围有限。

而随着紫外可见分光光度
计的迅猛发展，目前市场上紫外可见分光光度计的吸光度测量范围甚至可达到
8.000，远超过检定规程中所涉及的范围，有不少客户提出了检定规程覆盖范围之外的校准需求。

线性范围是紫外可见分光光度计性能高低的重要指标，在该范围内仪器的吸光度响应值与被测物浓度的线性关系良好，超出该范围后则线性变差。

因此为了判别紫外可见分光光度计在整个吸光度测量范围内的性能，笔者通过实验对紫外可见分光光度计线性范围的校准进行研究，提出了相应的校准方法与技术指标。

1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
紫外可见分光光度计：Lambda 25型，美国铂金埃尔默公司；
重铬酸钾纯度标准物质：编号为GBW(E)060018i，纯度标准值为99.96%，扩展
不确定度U=0.02%(k=2)，中国计量科学研究院；
硫酸：分析纯，稀释至0.005 mol／L的硫酸溶液使用，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验环境条件
参照JJG 178–2007 《紫外、可见、近红外分光光度计检定规程》中的环境要求，在温度10～35℃、相对湿度不大于85%的环境下进行实验。

1.3 标准溶液的配制
取适量的重铬酸钾纯度标准物质，用0.005 mol／L的硫酸溶液配制成重铬酸钾质量浓度分别为 0.024，0.048，0.072，0.096，0.120，0.144，0.168，0.192，
0.216，0.240，0.264，0.288，0.312，0.336，0.360 mg／mL的系列标准溶液。

1.4 实验方法
参照美国食品药品监督管理局(FDA)对紫外可见分光光度计的仪器认证中吸光度的测量［16］，选用重铬酸钾作为线性范围测量的纯度标准物质，用紫外可见分光
光度计按照浓度由低到高的顺序测量重铬酸钾系列标准溶液的吸光度，测量波长为与检定规程相同的 4个波长，即 235，257，313，350 nm。

由此便可得到4个
波长下不同浓度重铬酸钾溶液的吸光度。

以重铬酸钾溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标进行线性拟合，得到这4个波长下的线性数据。

参照JJG 705–2014
《液相色谱仪检定规程》［17］中紫外–可见光检测器和二极管阵列检测器的线性范围的测量，以线性在高浓度下开始发生偏离的浓度点作为线性范围的上限，以最小检测浓度作为线性范围的下限。

2 结果与讨论
2.1 吸光度的测量
按1.4实验方法测得的4个波长下不同浓度重铬酸钾溶液的吸光度见表1。

2.2 测量波长的确定和线性范围上限的测量
将表1中每个波长的数据分别以重铬酸钾溶液液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐
标进行线性拟合，如图1～图4所示。

表1 4个波长下不同浓度重铬酸钾溶液的吸光度浓度／(mg ·mL–1)吸光度235 nm 257 nm 313 nm 350 nm 0.024 0.307 9 0.350 4 0.119 7 0.259 2 0.048
0.624 1 0.708 4 0.242 0 0.519 5 0.072 0.920 7 1.061 3 0.358 9 0.781 5 0.096
1.238 4 1.427 1 0.482 2 1.048 4 0.120 1.538 8 1.771 3 0.598 3 1.299 1 0.144
1.829 9
2.099 0 0.708 2 1.532 5 0.168 2.114 7 2.399 2 0.822 5 1.766 7 0.192
2.418 4 2.708 9 0.948 2 2.002 5 0.216 2.668 0 2.913 5 1.052 1 2.200 1 0.240
2.930 4
3.124 1 1.191 9 2.412 1 0.264 3.097 5 3.211 5 1.309 3 2.563 8 0.288
3.250 8 3.320 9 1.376 8 2.654 6 0.312 3.378 0 3.409 5 1.476 6 2.718 5 0.336 3.477 5 3.465 2 1.578 3 2.821 0 0.360 3.501 1 3.451 2 1.710 3 2.872 1
图1 波长235 nm时不同浓度重铬酸钾溶液的吸光度
图2 波长257 nm时不同浓度重铬酸钾溶液的吸光度
图3 波长313 nm时不同浓度重铬酸钾溶液的吸光度
图4 波长350 nm时不同浓度重铬酸钾溶液的吸光度
由图1～图4可以看出，波长313 nm时重铬酸钾溶液的吸光度值较低，并且仍然呈现较好的线性，其它3个波长条件下，在重铬酸钾溶液浓度较低时呈现良好的线性，而在浓度较高时曲线趋于平缓，线性明显变差，表明已超出了线性范围的上限。

因此可以确定线性范围上限的具体浓度点就在这个浓度范围之内。

将4个监测波长下各个浓度范围的线性相关系数列于表2。

由表2可知，313 nm波长条件下的线性相关系数直至重铬酸钾溶液浓度达到0.360 mg／mL时依然保持在0.999以上，这是因为重铬酸钾溶液在波长313 nm时的吸光度较小，即便浓度达到0.360 mg／mL时其吸光度也只有1.710 3(见表1)，远小于其它3个波长条件下测得的吸光度。

若想得到313 nm波长条件下线性范围的上限，还需要将重铬酸钾溶液浓度继续递增。

因此对于线性范围的计量校准而言，313 nm波长条件下
吸光度随浓度变化缓慢，灵敏度较低，不适合作为线性范围计量校准的波长。

表2 4个检测波长下各个浓度范围的线性相关系数相关系数235 nm 257 nm 313 nm 350 nm 0.024～0.096 0.999 9 1.000 0 0.999 9 1.000 0 0.024～0.120
0.999 9 0.999 9 0.999 9 0.999 9 0.024～0.144 0.999 9 0.999 8 0.999 8 0.999 7 0.024～0.168 0.999 8 0.999 5 0.999 8 0.999 6 0.024～0.192 0.999 9 0.999 4 0.999 9 0.999 6 0.024～0.216 0.999 7 0.998 0 0.999 8 0.999 2 0.024～
0.240 0.999 5 0.996 4 0.999 8 0.999 0 0.024～0.264 0.998 4 0.992 2 0.999 8 0.998 1 0.024～0.288 0.996 8 0.987 3 0.999 5 0.995 7 0.024～0.312 0.994 3 0.981 7 0.999 3 0.991 6 0.024～0.336 0.991 0 0.975 1 0.999 1 0.988 0
0.024～0.360 0.985 6 0.965 5 0.999 2 0.983 2浓度范围／(mg ·mL–1)
以各个浓度范围的最大浓度为横坐标，以各个浓度范围的线性相关系数r为纵坐标绘制曲线，结果如图5所示。

由图5可以看出，波长分别为235，257，350 nm 时的线性相关系数均随浓度范围的扩大而明显降低，其中波长257 nm时的下降趋势最为显著，也就是说波长257 nm用于线性范围计量校准的灵敏度高。

依照紫外可见分光光度计的一般使用要求，当线性相关系数大于0.997时认为线性良好。

而由表2可知，波长257 nm条件下，当重铬酸钾溶液浓度达到0.240 mg／mL时线性相关系数开始低于0.997。

而波长235 nm和350 nm条件下，线性相关系数开始低于0.997时的重铬酸钾溶液浓度均为0.288 mg／mL，大于257 nm条件下的对应浓度(0.240 mg／mL)，也证明了波长257 nm条件下线性范围校准的灵敏度高，因此选用257 nm作为紫外可见分光光度计线性范围计量校准的波长。

该台紫外可见分光光度计的线性范围上限即为257 nm条件下线性相关系数开始低于0.997之前的那个浓度，即0.216 mg／mL。

图5 不同波长下线性相关系数r随浓度范围的变化趋势
2.3 线性范围下限的测量和线性范围的确定
线性范围下限为该台紫外可见分光光度计的最小检测浓度。

参照JJG 694–2009 《原子吸收分光光度计检定规程》［18］，以噪声的标准偏差的3倍量值为基础，采用如下方法进行紫外可见分光光度计最小检测浓度的测量。

在1.2实验环境条件下，选用波长257 nm，连续测量11次空白溶液(0.005 mol
／L的硫酸溶液)的吸光度，计算得到11次测定结果的标准偏差s为0.000 040。

再将线性未发生偏离时的浓度范围0.024～0.216 mg／mL进行线性拟合，以重铬酸钾溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到拟合方程y=13.612x+0.082，其斜率k为13.612。

则最小检测浓度也就是线性范围下限CL=3s／k=8.82×10–6 mg／mL。

结合2.2中得到的线性范围上限，该台紫外可见分光光度计的线性范围为
8.82×10–6～0.216 mg／mL。

3 紫外可见分光光度计线性范围校准方法的确定
根据上述实验研究提出如下紫外可见分光光度计线性范围的校准方法。

3.1 校准环境条件
温度10～35℃，相对湿度不大于85%。

3.2 标准物质
重铬酸钾纯度标准物质：编号为GBW(E)060018i，纯度标准值为99.96%，扩展
不确定度U=0.02%(k=2)。

3.3 校准方法
按1.3方法配制重铬酸钾系列标准溶液，在波长257 nm条件下，用0.005 mol／L硫酸溶液进行吸光度调零，然后按照浓度从低到高的顺序测定重铬酸钾系列标准溶液的吸光度。

以前4个浓度点为首个浓度范围，即0.024～0.096 mg／mL，再以重铬酸钾溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标的进行线性拟合，得到相应的线性相关系数。

以此类推，分别对前5个浓度点、前6个浓度点、前7个浓度点……
进行线性拟合，得到对应的线性相关系数，直至线性相关系数低于0.997为止。

取线性相关系数低于0.997时的前一个浓度点为该台紫外可见分光光度计的线性范围上限CH。

在相同条件下，连续测量11次空白溶液的吸光度，按式(1)、式(2)计算该台紫外可见分光光度计的线性范围下限CL。

式中：s——11次空白吸光度测量值的标准偏差；
Ai——第i次的吸光度测量值；
——11次空白吸光度测量值的平均值；
n——测量次数，n=11；
CL——线性范围下限；
k——线性范围上限校准时所得到的拟合直线的斜率。

3.4 技术指标
参照JJG 178–2007 《紫外、可见、近红外分光光度计检定规程》中的吸光度覆盖范围与仪器噪声要求，结合线性范围上限与下限的校准方法，紫外可见分光光度计的线性范围下限应不大于1.0×10–3 mg／mL，上限应不小于 0.10 mg／mL。

4 结语
针对紫外可见分光度计线性范围的计量校准进行了实验研究与讨论，提出了紫外可见分光度计线性范围的校准方法与技术指标，覆盖了JJG 178–2007 《紫外、可见、近红外分光光度计检定规程》中没有覆盖的吸光度范围，能够实现紫外可见分光度计全范围吸光度的计量校准。

参考文献
【相关文献】
［1］吴文铭.紫外可见分光光度计及其应用［J］.生命科学仪器，2009，7(4): 61–63.
［2］王贵.紫外可见分光光度计及其应用［J］.广州化工，2016，44(13): 52–53.
［3］倪一，黄梅珍，袁波，等.紫外可见分光光度计的发展与现状［J］.现代科学仪器，2004(3):
3–7.
［4］汪正范，潘甦民，姜栋，等.紫外／可见分光光度计的市场分析及前景展望［J］.现代仪器与医疗，2006，12(1): 69–70.
［5］屈维均.紫外及可见分光光度计在造纸工业的应用［J］.造纸科学与技术，1983(4): 3–12. ［6］高武民，尹洪荣.紫外可见分光光度计在污水含油分析中的应用［J］.石油和化工设备，2006，9(6): 31–34.
［7］高丽丹.紫外可见分光光度计的特点及其在食品检验中的应用［J］.科技创新导报，2017，
14(33): 91–93.
［8］黎卫强.紫外可见分光光度计在食品检测中的应用［J］.企业科技与发展，2010(6): 15–16. ［9］张珊珊.紫外–可见分光光度计在药品检测中的应用［J］.科学与财富，2016(11): 758–759. ［10］熊立凡.紫外可见分光光度计及其在临床检验中的应用［J］.分子诊断与治疗杂志，1993(3): 7–14.
［11］商木树，孙金芳.紫外／可见分光光度计的定量测量功能在环境监测中的应用［J］.科学技
术创新，2017(5): 99.
［12］史政，戴妙妙，马会凯.紫外可见光分光光度计在环保监测领域的应用［J］.自动化仪表，2011，32(6): 64–66.
［13］张亚刚，樊莉，文彬，等.紫外可见分光光度法在共轭亚油酸定量分析中的应用［J］.新疆
石油天然气，2002，14(2): 49–64.
［14］夏广丽.分光光度法在葡萄酒分析中的应用［J］.中外葡萄与葡萄酒，2004(2): 60.
［15］ JJG 178–2007 紫外、可见、近红外分光光度计检定规程［S］.
［16］贺宁，郭毅，南璟，等.紫外可见分光光度计的FDA仪器认证方法探讨［J］.化学分析计量，2016，25(1): 76–77.
［17］ JJG 705–2014 液相色谱仪检定规程［S］.
［18］ JJG 694–2009 原子吸收分光光度计检定规程［S］.。