细菌鞭毛银染法技术

细菌鞭毛银染法技术
本文介绍了细菌鞭毛银染法技术，对操作者鞭毛染色大有帮助，其染色效果十分理想，值得同行们借鉴学习。

标签：细菌；鞭毛；银染法；培养基；玻片；染色
1资料与方法
1.1一般资料
1.1.1供试菌种枯草杆菌（Bacillus subtilis）.粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）由湖南师范大学微生物教室提供。

1.1.2培养基配方组成：牛肉膏10 g，蛋白胨15 g，琼脂15 g，氯化钠5 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2。

（牛肉膏、蛋白胨由杭州微生物试剂有限公司生产，琼脂由福建省石狮市宝双塔琼脂加工厂生产）。

按上述配方配好培养基后，用干净试管分装包捆好，经高压灭菌摆斜面冷却凝固, 然后放入冰箱冷藏24 h，使斜面析出冷凝水，为供试菌活化提供斜面培养基。

1.2方法
1.2.1载玻片洗涤新玻片的洗涤，用洗衣粉煮沸玻片1 h，然后用自来水冲洗干净，沥干后用95%的乙醇侵泡备用；用后玻片的洗涤，采取稀溶液洗涤法，将重铬酸钠或重铬酸钾50 g先溶解于850 mL自来水中，然后慢慢加热溶解，待冷却后除除加入100 mL浓硫酸，边加边搅动。

此溶液氧化能力极强，具有极强的去油污作用。

对处理玻片应放入溶液中加盖密封，（以防溶液氧化变质）。

一般侵泡2 d取出冲洗干净，沥干后用95%的乙醇侵泡备用。

如除污剂侵泡时间太长，会导致玻片变质不能使用。

对划伤较严重的玻片，建议不要使用, 以免影响染色效果。

1.2.2供试菌活化为增强细菌的活动力，将供试菌放在30℃的培养箱内连续培养活化五代（每代12 h）。

然后将最后一代转接放入31℃培养箱内培养12 h，作为细菌鞭毛染色的最佳时期。

1.2.3菌种稀释孵育取斜面活化菌种2~3环于盛有2 mL无菌水试管中,制成轻度浑浊的菌悬液，然后把试管直立于36℃水浴锅中孵育9 min，让菌体表面附着的鞭毛自然舒展游动。

实验表明，细菌孵育5 min，只有部分鞭毛舒展游动，染色效果欠佳；孵育18 min菌体鞭毛染色明显很大，与真实细菌差异较大；超过25 min后鞭毛从菌体上自然脱落，染色效果较差。

孵育好的菌悬液在操作时不要用手摇动试管，避免鞭毛脱落影响染色效果。

1.2.4染液配制鞭毛染液由媒染液和染色液组成。

媒染液由单宁酸5 g，三
氯化鉄1.5 g，氢氧化钠﹙1%﹚1.0 g，福尔马林（15%）2.0 mL，蒸馏水100mL 组成；染色液由硝酸银2 g，氢氧化氨（N滴），蒸馏水100 mL组成。

1.2.4.1媒染液配制把称量丹宁酸和三氯化铁药品同时放入100 mL蒸馏水中加热熔解，然后加入2 mL甲醛溶液和1mL NaoH，待药液混合后补足水量，过滤备用。

将该液置冰箱内保存3~7 d。

仍能使用。

1.2.4.2染色液配制须把握二个环节：第一个环节（褐色变为澄清的过程）：在100 mL硝酸银溶液中取10 mL作回滴液，然后在90 mL溶液中滴加氢氧化铵，使无色的硝酸银溶液全部变为褐色时，继续滴加氢氧化铵至到溶液中的褐色沉淀刚刚消失变澄清为止；第二个环节(沉淀消失变为稳定薄雾状的过程)：澄清硝酸银溶液滴加回滴液，当出现白雾，轻轻摇动后，薄雾状沉淀又消失，再继续小心滴加，直到摇动后出现轻微而稳定的薄雾状，停止加入回滴液即可。

密封保存冰箱内3~7 d方可使用。

1.2.5制片染色节用镊子在95%乙醇溶液中夹起一块载玻片, 在火焰上烧去玻片上的残留油迹, 然后把玻片放在桌面上形成一定的倾斜度,在玻片的上端滴上一滴孵育后的菌悬液，让悬液从玻片的一端缓慢流向另一端，用吸水纸吸去玻片下端的多余菌液，在室温下自然干燥。

当制片干燥出现一条浅灰色的菌膜带为止。

取少量媒染液覆盖在菌膜上媒染4 min，用蒸馏水冲洗至玻片下端流出无蓝色的清水为止，继续用染色液冲去残水，然后在涂片上滴加大量的染色液染色，当涂片染色部分变为深褐色时，立即用蒸馏水冲洗，放置室温下自然干燥。

如在气温较低的情况下，若加染色液显色较慢,可用木夹夹住染色涂片，在文火上加热沸腾，并及时补充蒸发掉的染色液，待染色玻片出现深褐色时立即用蒸馏水冲洗。

自然干燥。

在加热过程中，应及时补充蒸发掉的染色液，可避免菌体鞭毛脱落、断裂。

提高鞭毛的染色效果。

1.2.6镜检摄影镜检前，先用3∶7的乙醚和无水酒精组成的去污剂，把显微镜的光学部分檫试干净。

（用去污剂保护镜头，并延长显微镜的使用寿命）。

油镜观察：把制片放到载物台上摆正夹好,利用聚光镜的光源，将玻片上的褐色部分滴1~2滴香柏油, 用粗调把高倍镜慢慢放下和油接触（动作要轻避免损坏玻片和镜头），然后利用推进器移动在视野内观察菌体鞭毛。

实验完毕后，分3步把镜头处理干净，首先用檫镜纸把镜头上的油檫掉，然后用去污剂把镜头上的残留油迹檫干净，最后用檫镜纸檫一遍即可。

用生物摄影显微镜（YS100）观察结果并拍摄图片电脑保存。

2结论
2.1玻片洗涤如玻片油污洗涤不干净, 在制片时，菌液在斜面上滚动不易粘膜，在干燥的玻片上形成了一些断断续续的斑块性菌膜,细菌鞭毛堆积成团, 鞭毛交叉粘连。

说明洗涤玻片是鞭毛染色成功不可疏忽的问题之一。

2.2配方改进将原配方牛肉膏5 g，增加为10 g，蛋白胨10 g，增加到为15
g，琼脂1.8%~2.0%减少为1.5%。

此配方提供了大量的维生素生长因素，使培养基营养更丰富，培养基硬度更适宜，斜面培养物明显比原培养基丰厚得多，更利于枯草杆菌和粘质沙雷氏菌的鞭毛形成和生长，粘质沙雷氏菌，细菌不但鞭毛多，粗状，鞭毛染色效果好，而且着色更容易而均匀。

图片背景浅褐色且非常干净，见图1。

图1 粘质沙雷氏菌（周生鞭毛）×100
2.3鞭毛生长线根据实验结果划分为4个生长期。

鞭毛生长初期：当温度为27℃时培养8 h，少数鞭毛生长短小；鞭毛生长期: 当温度为29℃时培养10 h，大部分鞭毛生长细长；鞭毛生长最佳期: 当温度为31℃时培养12 h，鞭毛生长多，粗状，易着色且均匀，是鞭毛染色的最佳时期；鞭毛生长脱落期：当温度为33℃时培养14 h，鞭毛开始大量脱落，不利于鞭毛染色。

如图2为枯草杆菌和粘质沙雷氏菌鞭毛生长线，实验表明，若菌龄培养12 h，是鞭毛染色的最佳时期，其他大于或小于12 h都不利于鞭毛染色。

2.4菌液孵育孵育温度和时间是鞭毛染色成功的关键之一，细菌孵育<5 min，鞭毛只有部分舒展游动，染色效果欠佳；孵育18 min，菌体鞭毛染色明显与真实细菌差异较大；孵育25 min后鞭毛从菌体自然脱落，染色效果较差。

2.5水洗与媒染如媒染后，用蒸馏水冲洗不充分，菌体鞭毛都变为深蓝色，蓝色背景并伴有大小不等的颗粒状物；如媒染液用量过多，所产生的染液气泡，在背景中形成許多灰白色的斑块，且伴有大小不等的颗粒状物，把握上述情况影响了制片效果。

参考文献：
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