HPLC法同时测定余甘子中5种成分的含量及主成分、聚类分析

HPLC法同时测定余甘子中5种成分的含量及主成分、聚类分析
目的：建立同时测定余甘子中5种成分含量的方法，同时对广西不同产地余甘子中5种多元酚类成分的含量进行主成分分析和聚类分析。

方法：采用高效液相色谱法测定余甘子中没食子酸、没食子儿茶素、柯里拉京、诃子联苯酸、鞣花酸的含量。

色谱柱为Agilent Eclipse XDB，流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为220 nm，柱温为25 ℃，进样量为20 μL。

对含量测定结果进行主成分分析和聚类分析。

结果：没食子酸、没食子儿茶素、柯里拉京、诃子联苯酸、鞣花酸检测质量浓度线性范围分别为 1.994～31.90、0.159 8～2.556、4.533～45.33、14.75～88.49、2.956～47.30 μg/mL（r均≥0.999 8）；检测限分别为0.025 6、0.027 1、0.052 9、0.186 7、0.133 1 μg/mL，定量限分别为0.085 1、0.089 3、0.170 6、0.615 2、0.441 9 μg/mL；精密度、稳定性（24 h）、重复性试验的RSD均1.5，其他成分对待测成分的测定无干扰，理论板数以没食子酸、没食子儿茶素、柯里拉京、诃子联苯酸、鞣花酸峰计均>3 000，色谱图见图1。

2.4 线性关系考察
精密量取“2.2.1”项下对照品贮备液A 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL，对照品贮备液C 0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mL，对照品贮备液E 1.5、3.0、6.0、12.0、15.0 mL，对照品贮备液F 2.0、4.0、8.0、10.0、12.0 mL，对照品贮备液G 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL，分别置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇定容，制成系列混合对照品溶液。

精密量取上述系列混合对照品溶液各20 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。

以没食子酸、没食子儿茶素、柯里拉京、诃子联苯酸、鞣花酸质量浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）进行线性回归。

线性关系考察结果见表2。

2.5 检测限与定量限考察
取“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。

当信噪比为3 ∶1时，得检测限；当信噪比为10 ∶1时，得定量限。

结果，没食子酸、没食子儿茶素、柯里拉京、诃子联苯酸和鞣花酸的检测限分别为0.025 6、0.027 1、0.052 9、0.186 7、0.133 1 μg/mL，定量限分别为0.085 1、0.089 3、0.170 6、0.615 2、0.441 9 μg/mL。

2.6 精密度试验
取“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积，计算日内精密度；连续进样测定3 d，计算日间精密度。

结果，没食子酸、没食子儿茶素、柯里拉京、诃子联苯酸、鞣花酸峰面积的日内精密度RSD分别为0.21%、0.88%、0.14%、0.20%、0.64%（n=6），日间精密度RSD分别为0.26%、1.42%、0.25%、0.24%、0.67%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验
取“2.2.3”项下供试品溶液（编号S5）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、10、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。

结果，没食子酸、没食子儿茶素、柯里拉京、诃子联苯酸、鞣花酸峰面积的RSD分别为0.45%、0.63%、0.27%、0.57%、0.60%（n=7），表明供试品溶液在室温放置24 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验
精密称取编号S5的生品约0.1 g，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并扣除生品（编号S5）含水量后，再计算含量。

结果，没食子酸、没食子儿茶素、柯里拉京、诃子联苯酸、鞣花酸含量平均值分别为2.314 4、0.109 1、6.138 6、12.394 5、1.938 1 mg/g，RSD分别为0.76%、1.38%、0.55%、0.84%、1.02%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验
精密称取已知含量的“1.3”项下生品（编号S5）约0.05 g，共6份，分别加入一定体积的“2.2.1”项下对照品贮备液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并扣除生品（编号S5）含水量计算，结果见表3。

2.11 主成分分析
主成分分析具有降维思想，可以把多个指标转化为少数几个综合指标，使这些少数的综合指标又能尽量多地反映原来较多指标所反映的信息。

通过SPSS 25.0软件对12批样品含量测定结果进行主成分分析。

结果，特征值>0.95的前3个主成分累积方差贡献率为85.753%，能基本说明样本大部分信息，见表5、表6。

主成分1贡献度最显著，其中没食子酸、没食子儿茶素、鞣花酸载荷较高，说明主成分1主要反映了这3种成分指标的信息；主成分2主要体现诃子联苯酸的信息；对主成分3贡献最大的是柯里拉京。

根据各主成分得分进行综合评价，其综合得分（F）=0.513 1×F1+0.265 4×F2+0.221 5×F3，结果发现所收集的样品中编号S9的综合得分（F）最高，药材质量较好，结果见表7。

2.12 聚类分析
为了考察广西余甘子中5种成分的含量差异与产地之间的相互关系，通过SPSS 25.0软件和欧式距离系数对12批样品进行聚类分析。

当15<阈值<25时，可分为两类，第Ⅰ类：S11；第Ⅱ類：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S12。

结合主成分得分排序，可知S11质量稍差。

当5<阈值<9时，可将第Ⅱ类细分为四类，第1类：S4、S9、S1，在表7评价排序中分别为第4、1、3位；第2类：S2、S10，在表7评价排序中分别为第5、2位，第1类和第2类
又可聚成一类，说明这两类质量较好，可见排第1、2位广西玉林市容县的质量最好。

第3、4类中S12、S3、S8、S5、S6、S7在表7评价排序中为第6～12位（第9位除外），说明这两类质量稍差，结果见图2。

3 讨论
笔者在预试验中考察了用25%甲醇、50%甲醇、甲醇对余甘子的超声提取率，结果其提取率分别为11%、19%、19%，结果显示50%甲醇和甲醇的超声提取率较高。

因鞣花酸具水难溶性[15]，在低浓度甲醇中溶解性能较差，而高浓度甲醇提取出的杂质成分较多，检测易造成干扰，故采用50%甲醇作为提取溶剂。

预试验二极管阵列检测器图谱分析结果显示，没食子酸、没食子儿茶素、柯里拉京、诃子联苯酸和鞣花酸分别在270、220、280、254 nm波长处有最大吸收。

在220 nm波长处基线平稳，色谱峰相互之间分离效果较好，且各峰形较好，故选择检测波长为220 nm。

当有机相选用甲醇时，流动相梯度洗脱过程中基线波动较大，而当乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相时，基线平稳，各色谱峰分离效果也较好，故选择乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相。

在化学结构上，多元酚类化合物是氢或电子供体，因具有酚类游离基中间体的共振非定域作用和没有适合分子氧进攻的位置，所以比较稳定，不会引起新的游离基或者因链反应而被迅速氧化[16]，因此具有抗氧化作用。

另据文献[17]报道，多元酚类化合物在余甘子中含量高达12.9%，而没食子酸是余甘子中多元酚类化合物的主要成分。

这与表6中没食子酸、没食子儿茶素在主成分1中载荷较高相一致。

由表4可知，没食子酸含量在广西不同产地之间差异较大，梧州市藤县和平镇的没食子酸含量为9.478 7 mg/g，而钦州市灵山县平南镇的没食子酸含量为2.096 8 mg/g，相差近5倍，说明产地不同，化学成分的含量存在较大差异，为确保余甘子药材质量，应相对固定产地采收。

经主成分分析，表7中F值越大说明余甘子中成分综合含量越高，质量越好，由此可知S9质量较好。

经聚类分析，广西不同产地余甘子质量有差异。

基本按地域性聚成2类，其中1类又可细分为四小类：玉林市容县、梧州市藤县等地区分别聚成质量较好的两小类，崇左市龙州县、钦州市灵山县及百色市田林县等地区分别聚成质量稍差的另两小类，该分类符合地域分布特征。

但梧州市藤县个别地区与崇左市龙州县地区聚成一类，这也说明除不同分布区地理和气候因子影响外[18]，造成同一分布区质量差异还可能与当地的种植栽培条件等因素有关。

综上，本研究建立的方法操作简便、结果准确可靠，可用于余甘子中没食子酸、没食子儿茶素、柯里拉京、诃子联苯酸、鞣花酸含量的同时测定。

另外，在同时测定余甘子中5种成分含量的基础上，结合主成分分析和聚类分析，提示广西不同产地余甘子质量有差异。

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