流式细胞仪原理深度讲解

流式细胞仪原理深度讲解
流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。

它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。

一、流式细胞技术的应用
1.其测定细胞内DNA的变异系数最小，一般在2%以下；
2.能准确地进行DNA倍体分析；
3.借助于荧光染料进行细胞内蛋白质和核酸的定量研究；
4.快速进行细胞分选和细胞收集；
5.医学应用：免疫功能研究各种干细胞的检测，癌症病人的多药耐药性，细胞功能及代谢动力学研究，血小板分析（心血管疾病），流式细胞术与分子生物学研究；
6 应用于外周血内皮细胞测定、调节性T细胞等尖端领域。

二、流式细胞仪的结构
流式细胞仪（FCM）结构一般分为5部分：
流动室及液流驱动系统；
激光光源及光束成形系统；
光学系统；
信号检测、存贮、显示、分析系统；
细胞分选系统。

01
流动室及液流驱动系统
流动室（Flow chamber）是仪器核心部件，被测样品在此与激光
相交。

流动室充满鞘液，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等。

图：FCM的流动室和液流系统
02
激光光源与光束成形系统
目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。

激光是一种相干光源，提供单波长、高强度、稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。

激光光束在达到流动室前，先经过透镜聚焦，形成稍大于细胞直径的光斑。

03
光学系统
FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。

在FCM的光学系统中主要光学原件是滤光片（Filter），主要分成3类：长通滤片（long-pass filter，LP）、短通滤片（short-pass filter，SP）及带通滤片（band-pass filter，BP）。

长通滤片：长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。

如LP500滤片，将允许500um以上的光通过，而500um以下的光吸收或返回。

短通滤片：与长通滤片相反，特定波长以下的光通过，特定波长以上的光吸收或返回。

如SP500滤片，将允许500um以下的光通过，而500um以上的光吸收或返回。

带通滤片：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。

如BP500/25表示其允许通过波长范围为475um-525um。

04
信号检测与分析系统
散射光信号：散射光分为前向角散射（forward scatter，FSC）
和侧向角散射（side scatter，SSC），散射光不依赖任何细胞样品的制备技术（如染色），因此被称为细胞的物理参数或称固有参数。

1）前向角散射：前向角散射与被测细胞的大小有关，确切说与细胞直径的平方密切相关，通常在FCM应用中，选取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。

2）侧向角散射：侧向角散射是指与激光束正交90⁰方向的散射光信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。

以上两种信号都是来自激光的原光束，其波长与激光的波长相同，目前采用这两个参数组合，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。

荧光信号：当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。

一种是细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特殊荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析，就能了解所研究细胞参数的存在与定量。

激光作用原理
05
FCM测量数据的显示分析
数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。

图：肺癌细胞DNA含量的Modifit LT分析直方图（横坐标——DNA含量；纵坐标——细胞数量）
图：肺癌细胞DNA含量的CellQuest分析直方图（横坐标——FL2-A：细胞面积；纵坐标——细胞数）
图：肺癌细胞DNA含量的假三维图
图：肺癌细胞DNA含量的二维散点图
FL2-W——细胞宽度；FL2-H——细胞面积
图：肺癌细胞DNA含量的等高线图
FL2-W——细胞宽度；FFL2-A——细胞面积三、补偿调节
流式仪通过内置激光器激发荧光染料，将488nm 或633nm 的光转变为另一波长的光，并通过光电倍增管将光信号转变为电信号，由计算机统计处理变为可读数据。

激光光源
激发光波长（nm ） 发射光峰值（nm ） 氩离子气体激光管 FITC
488 525（绿） PE 488
575（橙红） PI 488
630（橙红） Cy5 488
675（深红） PerCP 488
675（深红） 氦氖离子气体激光管 APC 633
660（红） APC-Cy
633 767 事实上，各荧光素的发射波长呈正态或偏态分布，如图。

若同时使用两种荧光染料，就会出现发射光谱相互叠加的现象。

图：受激光照射后FITC 和PE 分子发射光谱互相干扰图
FITC 无PE 荧光检测补偿调节示意图
PE无FITC荧光检测补偿调节示意图
A：阴性对照管（IgG-FITC/IgG-PE）
通过调节电压，使阴性群体落在FITC及PE双阴性区。

阴性对照实际为没有特异性的、与抗体蛋白亚型一致的动物免疫球蛋白。

由于化学键、生物键及分子之间的吸引作用，这些蛋白会与标本中的细胞结合，在流式细胞仪上可检出一定的信号。

当荧光特异性抗体与标本结合时，会产生两部分信号：非特异信号（即同阴性对照的信号）和特异性结合信号。

所以我们只认为大于阴性对照的信号才是由特异结合而引起的信号并将其归入统计范围。

图：PE和FITC分子的阴性对照
B：FITC标记抗体/IgG-PE）
在理想情况下（没有荧光干扰），因为检测管中只含有PE标记的
IgG阴性对照，所以仍将没有任何信号出现。

但实际上，在PE坐标上出现了阳性信号。

这个信号就是由于FITC荧光漏入PE探测器中而引起的。

此时就要取一合适百分比的FITC信号相乘后去抵消PE中的信号。

（此时电压已通过阴性对照设定，绝对不可变动！）
未调节补偿的双参数直方图
当将FITC漏入PE的信号恰好全部减除时，即PE信号与原本本底相同时，此时的补偿便是正确的，即FITC单阳性细胞的PE的平均荧光强度与双阴性细胞PE荧光强度一致。

由上图可知，调节荧光补偿首先要知道双阴性细胞的情况，即通过A管调节电压确定阴性范围。

其次，在检测FITC标记管中，必须存在阳性细胞和阴性细胞；只有这样才能有本底参照将PE的信号降至与本底一致而不会过多或过少的调节补偿。

图：FITC荧光信号补偿的调节
四、设“门”
流式细胞术数据分析目的就是需要确定所要研究的目的细胞器,这就涉及到设门。

设门就是划定某一区域的细胞群体,对其单独加以分析或分选。

门的形状可任意,方法有：
(1)阈值设门。

FSC(前向散射光)是最常用的阈值参数。

FSC 和细胞的大小正相关。

用FSC 设阈值,可以使低于该阈值的细胞碎片等其他杂质的信号不被处理。

(2)散射光设门。

以FSC 和SSC(侧向散射光)联合设门较常用。

其最大优点是可以排除碎片或噪声的。

可以根据FSC vs SSC 散点图上不同细胞分布不同来设门目的细胞群。

注意事项
设门是一种主观行为，所以要尽可能客观。

需要考虑以下因素：
1、排除细胞碎片（建立一个FSC vs SSC点图，确定所有分析细胞群在点图可视范围内，细胞碎片、气泡和激光背景噪的感染设在FSC-low的区域，在SC vs SSC中圈出感兴趣的细胞群的周围区域R1，这个区域可以被称为R1-FSC vs SSC）
2、应用合适的荧光阴性对照（对照组用荧光同型抗体感染靶细胞，以区分阳性信号和阴性荧光背景。

）
3、排除死细胞（用PI或者7-ADD标记活细胞，然后圈出活细胞区域）
4、如果合适，使用一种共享标记物
5、设置必需的荧光分析点图
淋巴细胞分型——双色法检测外周血T、B、NK细胞试剂组合Tube Number FITC PE Use
1 CD45 CD14 光散射坐标设门
2 CD
3 CD19 总T和B淋巴细胞
3 CD3 CD
4 总T和CD4阳性T淋巴细胞
4 CD3 CD8 总T和CD8阳性T淋巴细胞
5 CD3 CD16+CD5
6 总T和NK细胞
淋巴细胞分型—— CD14/CD45设“门”确定淋巴细胞
T、B和NK细胞百分比总和应等于100%的淋巴细胞，但在实际中由于在FSC vs SSC中淋巴细胞设“门”中，会混入细胞碎片、单核及粒细胞，所以很难达到100%的比例。

如运用CD14/CD45设门来确定淋巴细胞“门”，则CD3细胞百分比+ CD19细胞百分比+ CD3-/(CD16+56)+细胞百分比应等于CD14/CD45中淋巴细胞百分比±5%，最大不得超过±10%。

淋巴细胞分型——CD3/CD19区分T、B淋巴细胞
CD3是T细胞特异性抗原，CD19则可用来识别B细胞。

若用CD3/CD19双标试剂，没有双阳性细胞群体存在，CD3、CD19表达为独立的单阳性细胞群体。

这样就可不用同型对照来设定阴性或阳性界限。

CD3/CD19不仅可用来设定标本的阴性和阳性界限，它还可用来检查仪器的补偿设置和非特异性结合。

应用该组合检测时，会出现3群彼此独立的细胞群，如细胞分群不清或位置发生偏差则要对样本进行仔细分析。

用荧光标记双参数检测外周血成熟T细胞（CD3+/CD19-细胞为80.65%）
淋巴细胞分型—— CD3/CD4鉴定CD4+ T淋巴细胞
首先用CD3来区分全部T细胞。

CD3/CD4双阳性的为真正的Th 细胞。

这些细胞主要是HIV病毒感染对象。

CD3-/CD4+细胞群体是由单核细胞组成的。

这些细胞相对于CD4+T细胞来说弱表达，在光散射参数的位置分布也较广。

CD3/CD4抗体组合能完全将CD4+T细胞与CD4+的单核细胞区分开来。

此管也可检测补偿及非特异性结合情况。

CD3+/CD4-细胞群体应明显地与CD3/CD19中CD3+细胞群位置相重合。

用荧光标记双参数检测外周血辅助T细胞（CD3+/CD4+细胞为4.65%）
淋巴细胞分型—— CD3/CD8鉴定CD8+ T淋巴细胞
同时表达CD3/CD8的细胞群才是真正的CD8+T淋巴细胞，CD8的表达包括弱阳性和强阳性部分。

CD3-/CD8+细胞包括一部分NK细胞和少数粒细胞。

这些细胞弱表达CD8+，由于缺少CD3，易于从CD3+/CD8+T淋巴细胞相区别。

双标试剂可用来检查补偿设置和非特异性结合情况。

双阴性细胞可视作内部的阴性对照。

CD3阳性群体应与CD3/CD19、CD3/CD4中的CD3阳性群体处于同一位置。

用荧光标记双参数检测外周血抑制T细胞（CD3+/CD8+细胞为19.00%）
淋巴细胞分型—— NK细胞
CD16（FcRⅢ）表达于大多数NK细胞上，但也表达于中性粒细胞上，这种抗原在NK细胞的表达比较弱并在NK细胞活化时丢失。

CD56表达于大多数的（但并不是全部）NK细胞上，也表达于一些T淋巴细胞上。

与CD3联合使用，可以区分CD3+/CD56+T淋巴细胞和CD3-/CD56+NK细胞。

联合使用三种单抗能最完全的鉴定所有的NK细胞。

NK细胞或表达CD16，或表达CD56，但它们不表达CD3。

CD16和CD56联合使用，根据荧光强度可将NK细胞从双阴性细胞中区分出来。

这样运用该组试剂，NK细胞可形成独立的群体与其它细胞相区分。

图：用荧光标记双参数检测外周血NK细胞（CD3-/CD(16+56)+细胞为14.43%）。