食品微生物实验指导书

实验四酸奶/泡菜中乳酸菌的分离、纯化
一、实验目的
1、巩固无菌操作的基本环节和几种接种技术；
2、了解微生物分离和纯化的原理；
3、掌握分离纯化乳酸菌的方法。

二、实验原理
乳酸发酵是指微生物将己糖分解产生乳酸的生物学工程。

能够引起乳酸发酵的微生物种类很多，其中主要是细菌，常见的乳酸细菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。

乳酸细菌生成的乳酸，能抑制一些腐败细菌的活动。

这类菌在自然界分布广泛，乳制品、葡萄酒、泡菜、酸奶等都可以分离到乳酸菌。

乳酸菌常用的分离培养基有麦芽汁碳酸钙培养基、BCP 培养基和西红
柿碳酸钙培养基等，在选用培养基时不能只局限于一种培养基，以免乳酸菌某些菌株在个别培养基上不生长而造成分离失败。

乳酸菌是兼性厌氧微生物，菌体细胞通常不运动，不产芽孢，是革兰氏阳性菌。

它们生物合成能力较差，需要有糖存在的习性，营养要求包括多种氨基酸、维生素和微氧。

这类菌缺乏卟啉和细胞色素，接触酶（过氧化氢）阴性，不能使H2O2 分解。

三、实验器材
培养基：BCP 培养基（乳糖5g、蛋白胨5g、酵母膏3g、琼脂15-20g、溴甲酚紫0.05g、蒸馏水1000mL，pH6.8-7.0，115℃灭菌20min）；西红柿碳酸钙培养基（葡萄糖10g、酵母膏7.5g、蛋白胨7.5g、磷酸二氢钾2g、碳酸钙15-20g、吐温80 0.5mL、琼脂20g、番茄汁
100mL（新鲜番茄洗净切碎放入烧杯中，4℃静置8-12h，取出纱布过滤即可）、蒸馏水
900mL，pH7.0，121℃灭菌20min）；BCG 牛乳培养基[A 液：脱脂乳粉100g、水500mL、1.6%溴甲苯酚绿乙醇溶液1mL（1.6g 溴甲苯酚绿溶于20mL 无水乙醇，再加水定容至
100mL）、80℃ 灭菌20min；B 液：酵母膏10g、水500mL、琼脂20g，pH6.8、121℃灭菌20min；A液和B 液以无菌操作趁热混匀]。

材料：酸奶或泡菜汤、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿、培养箱等。

四、操作步骤与内容
1、培养基的配制
①每组配制各150mL BCP 培养基和西红柿碳酸钙培养基（放灭菌锅中保温）；
②盛9mL 蒸馏水的3 支试管、6 套培养皿、10mL 移液管3 支、盛90mL 蒸馏水
的三角瓶（9 个），包扎，于121 高压蒸汽灭菌20min。

（灭菌完冷却至室温）
2、菌悬液的配制
按10 倍稀释度的方法稀释，先用盛90mL 无菌水的三角瓶进行稀释，分别稀释成10-1、
10-2 和10-3 稀释液，再用盛9mL 无菌水进行稀释，分别稀释成10-4、10-5、10-6 和10-7。

3、倒平板（稀释混合平板法直接做4-②步骤，西红柿碳酸钙培养基倾倒时摇匀）
①稀释涂布平板法
做2 个稀释度10-5、10-6 和10-7，每个稀释度做2 个平行并表明编号（10-5、10-6、10-7），将灭菌好的培养基冷到45℃左右，按无菌操作倒平板（每皿15mL），待凝固。

②平板划线法
做2 个稀释度10-2 和10-3，每个稀释度做3 个平行并表明编号（10-2、10-3），将灭菌好
的培养基冷到45℃左右，按无菌操作倒平板（每皿15mL），待凝固。

4、分离（1~3 组涂布、4~7 组稀释混合、8~10 组划线）
①稀释涂布平板法
用 1mL 无菌吸管分别吸取 0.2mL 的 10-5 和 10-6 稀释液，对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀（图 3）。

② 稀释混合平板法
此法与稀释涂布平板法基本相同，无菌操作也一样，先分别吸取 1mL 的 10-5、10-6 和 10-7 稀释液，对号放入已写好稀释度的平板中，然后再倒入熔化后冷却到 45℃左右的培养基，边倒入边摇匀，使样品中的微生物与培养基混合均匀（图 4），冷凝成平板。

图 3 稀释涂布平板法图 4 平板摇匀方式
③ 平板划线法
划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述 10-2 和 10-3 的菌悬液一环在平板上划线。

划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。

常用的划线方法有下列二种：
a ．用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线 3-4 条，再转动培养皿约 70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。

划线完毕后，盖上皿盖，倒置于培养箱培养（图 5）。

图 5 平板
划线分离操作示意图 b ．将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。

划线完毕后，盖上皿盖，倒置培养箱培养。

5、培养与鉴定
BCP 培养基和西红柿碳酸钙培养基分别放置 25℃、37℃恒温箱中倒置培养 48h ，在 BCP 琼脂平板上，因产酸使培养基由紫色变为黄色，而在西红柿碳酸钙培养基，因产酸使碳酸钙溶解形成透明圈，将 3%过氧化氢溶液滴于菌落上，无气泡产生。

将上述特征的菌落进行革兰氏染色，呈阳性杆菌或链球菌，则可将其连续传代 3 次（脱脂乳试管：脱脂乳 10g 、蔗糖
5g 、水 95mL ，115℃、15min ），最终筛选出 3~6h 能凝固的牛乳管做菌种待用。

注：期间都
需要严格的无菌操作。

乳酸菌菌落形态保
加利亚乳杆菌
嗜热链球菌某品牌乳酸菌
五、实验结果
1．在你所实验的培养基平板上长出的菌落生长情况？简述它们的菌落形态特征并拍照。

2．单个菌落低倍镜显微镜图。

3．分离结果图（平板全图）及革兰氏染色图。

六、思考题
1．在平板划线法中，为什么每次都需将接种环上的剩余物烧掉？
2．为什么要将培养皿倒置培养？
3．列表比较各种接种方法的特点和用途？
4．酸奶或泡菜中大量生长的乳酸菌来自何处？为何它们能成为优势菌群？
实验五 D 值的测定
一、实验目的
1、巩固培养基的配
制、灭菌、仪器的包扎、
倒平板；
2、测定D 值二、实
验原理
1、微生物致死间曲线与D 值
人们对微生物死亡的动力学研究表明，其死亡速度属一级过程，在一定温度下符合下述方程式：
K t
log N t l og N0
2.303
式中：N0—为原始微生物数；
N t—为残存的微生物t 时残存的微生物。

残存数的对数时间作图，得一条直线，直线的斜率＝K/2.303，K 为速度常数，单位为时间。

为了方便起见，引用D，并定义D 为一定温度下杀死被灭菌物品中微生物娄90％所需时间，则
2.303 2.303
D log100 log10
K K
因此，D 也可定义为降低微生物一个十位数或一个对数值（如log100 降低到log10）所需的时间，如图1 所示。

D 值因微生物的种类、环境、灭菌温度不同而各异（表1）。

2、Z值一旦在不同温度下对特定的微生物的在特定介质或环境中求得D 值后，就可用logD
值对温度作图，在一定温度范围内，logD 与T 呈直线关系，直线的斜率=logD2-logD1／T2-T1。

由于此斜率为负值，为避免引入负数，而提出Z 值的概念，Z= T2-T1/logD2-logD1，故定义Z 值为降低一个logD 值所需的温度数，如图2 的单位为温度，也可以认为Z 值是降低微生物数90％所需要的温度数，表2 一些药物溶液的Z 值。

图 1 logN t 与t 的关系图图2 logD 与T 关系图表1 不同灭菌法不同微生物的D 值
三、实验器材
菌种大肠杆菌（Esaherichia Coli.）的新鲜培养液（150mL、含活菌数不大于107 个/ ml）。

培养基葡萄糖牛肉膏蛋白胨固体培养基（3g 牛肉膏、10g 蛋白胨、5g NaCl、5g 葡萄糖、18-20g 琼脂、蒸馏水1000ml、pH7.0-7.2）；葡萄糖牛肉膏蛋白胨液体培养基，分装250mL
三角瓶，每瓶装90mL。

材料水浴锅、平板、吸管、三角瓶、无菌水、试管、试管架等。

四、操作步骤和内容
1．每组需制150mL 固体培养基和90mL 液体培养基分别装于三角瓶中、盛9mL 蒸馏水的
试管6 支，培养皿6 套，10mL 移液管1 支，包扎。

2、1mL 移液枪头，包扎。

3、上述包扎好的实验器材于121℃灭菌15min。

4、打开水浴锅，设置温度为60℃。

5、灭完菌后，固体培养基于灭菌锅中保温，而液体培养基冷却至60℃左右。

6、将液体培养基置于60℃的水浴锅中预热20min（注意不要把纱布弄湿）。

7、分别吸取大肠杆菌培养液10ml，接种于上述预热后的液体培养基中（超净台里操作），
混匀成10-1 菌悬液，放入60℃的水浴锅中，开始计时。

8、分别按保温0min（10 组）、5 min（9 组）、10 min（8 组）、15 min（7 组）、20 min（6
组）、
30 min（5 组）、40 min（4 组）、50 min（3 组）、60 min（2 组）、70min（1 组）后，取出菌
悬液，水龙头上迅速冷却（注意不要把纱布弄湿）。

9、先将平板编号（如8~10 组，每2 个平板编成10-5，10-6，10-7）。

按10 倍稀释法将上述
菌
悬液稀释成10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，选取10-5，10-6，10-7 稀释度（8~10 组）、10-4，10-5，10-6 稀释度（5~7 组）、10-1，10-2，10-3 稀释度（1~4 组），每个稀释液分别注入两个培养皿，每皿1mL 稀释液。

10、采用混合稀释法，将固体培养基倒入已注入1mL 稀释液的培养皿中（固体培养基
15-20mL），混合均匀。

（注意：因超净台、移液枪有限，请不要急于冷却固体培养基，带有空时，方可冷却培养基，以免培养基凝固。

为了数据准确，从第9 步梯度稀释到第
10 步固体培养基混匀需20min 内完成）。

11、37℃倒置培养48 小时，计算菌落数，平皿上菌落总数介于30-300 个之间。

12、以保温时间为横坐标，残存活菌数log 值为纵坐标，作出大肠杆菌在60℃时的残
存活菌
数曲线，求出大肠杆菌的D60 值。

五、计数方法
1、挑选菌落数在30~300 之间的平板作为菌落数的计数标准；
2、若只有一个稀释度平板上的菌落数符合计数标准，计算2 个平板菌落数的平均值，再乘
稀释倍数；
3、若2 个连续稀释度的平板菌落数符合计数标准，按n=ΣC/（n1+0.1n2）d 计算，其中ΣC
为平板菌落数之和；n1 为低稀释倍数的平板个数；n2 为高稀释倍数平板个数；d 为低稀释倍数的稀释度。

4、若所有稀释度的平板菌落数均>300/<30，则取最高/最低稀释度的平均菌落数乘以稀释倍
数；
5、若所有稀释度平板均无菌落生长，则应按<1 乘以最低稀释倍数；
6、若所有稀释度平板菌均不在30~300 之间，则应以最接近300 或30 的平均菌落数乘以稀
释倍数。

六、需具备知识 1、 灭菌锅的正确使用； 2、 移液枪的正确使用； 3、 超净台与接种使用； 4、 预习报告、实验报告撰写； 5、 培养基配制与实验场地清洁。

七、注意事项
1、 无菌操作：玻璃器皿完全灭菌、手需消毒（75%乙醇）、超净台消毒操作、三角瓶瓶口等：
2、 倒平板时，固体培养基温度不可太高（46℃水浴锅中保温）。

附：F 值测定
一、 实验原理
热力致死时间是指在一定的条件下，杀死一定数量的微生物所需要的时间。

微生物热力致死时间是食品消毒所需温度和时间的理论依据。

二、 实验器材
1．器材水浴锅、180mm×18mm 试管、吸管、平板、无菌水等。

2．菌种新鲜的大肠杆菌（Esaherichia Coli.）、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）培养液（含活菌数不大于107 个/ ml）。

3．培养基葡萄糖牛肉膏蛋白胨液体培养基，分装180mm×18mm 试管，每支装9mL，121 ℃灭菌30min 待用。

葡萄糖牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。

三、操作步骤
1．固体培养基融化，倒平板，冷却备用。

2．大肠杆菌、啤酒酵母、枯草杆菌培养液，依次编号：E、S、B。

3．将3 个水浴锅分别调至60℃、80℃、100℃，每个水浴锅放3 支葡萄糖牛肉膏蛋白胨液体培养基，编号为E、S、B 预热l0min。

4．分别取lml 大肠杆菌、酵母菌、枯草杆菌培养液接种于编号对应的葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养液中，摇匀，记时。

5．在0、5、10、15、20、30min 分别取不同的温度下，不同的菌液lml，稀释、涂平板，30℃培养48h 后计活活数。

6．将计数结果填入下表，从表中可以查出，在上述实验条件下，不同温度时，杀死一定数量的某种微生物所需要的时间。

实验六大肠杆菌生长条件的优化及其生长曲线的测定
一、实验目的
1.通过对大肠杆菌生长条件的探讨及其生长曲线的测定，综合训练微生物实验的基本实验技能。

2.巩固培养基的配制、灭菌、仪器的包扎、倒平板。

3.学习用比浊法测定细菌的生长曲线。

4.比较不同培养基的生长曲线二、实验原理
将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，一定时间测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生
长曲线。

它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。

依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数生长期、稳定期和衰亡期。

这4 个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所不同。

因此通过测定微生物的生长曲线，可了解个菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。

测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。

本实验用比浊
法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD 值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD 值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简单。

三、实验材料
菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），营养琼脂培养基：根据产品说明配制，生理盐水（0.9%NaCl）100mL，721 型分光光度计、比色杯、恒温摇床、高压灭菌器、电子天平、pH 计、酒精灯、电炉、接种环、烧杯（50mL、500mL）各9 个、锥形瓶9 个（250mL）、胶头、牛皮纸、纱布等。

培养基：本实验采取正交实验确定大肠杆菌最优的生长条件，采取L934 正交表，正交设计如下：表3 因素水平表
表4 正交试验设计
加
四、操作步骤和内容
1、操作流程
种子液标记接种培养测定（一般菌丝菌体505nm、酵母560nm、细菌600nm）
2、操作步骤
1）标记编号
按要求配制培养基（500mL）装于250ml 三角瓶(150mL)中，包扎、灭菌。

2）接种培养
用1mL 无菌吸管分别准确吸取1mL 种子液加入已编号的9 个三角瓶中，于37℃下在恒温摇床上培养（150r.min-1）（以上步骤均需在无菌操作台上操作）。

然后分别按0h，1h，2h，
3h，4h，5h，6h，8h，10h，12h（每组根据实际生长情况决定检测时间）的时间将三角瓶取出，测定OD 值。

3） 生长量的测定
以空气作为空白，在 600nm 下测量对 0h 、2h 、4h 、6h 、8h 、10h 、12h 、14h 、16h 、18h ， 20h （每组根据实际生长情况决定检测时间）的时间将三角瓶取出，测定 OD 值。

对浓度大的菌悬液用未接种的培养基适当稀释后测定，使其 OD 值在 0.1-0.65 之间，经稀释后测得的 OD 值要乘于稀释倍数，才是培养液实际的 OD 值。

五、实验结果 1、 生长曲线的比较
对所得数据进行生长曲线的绘制
大肠杆菌生长曲线
2、 通过极差分析和方差分析获得较适培养基配方（正交设计助手或 SPSS 等统计软件）。

O
D
值 时
间 /h
实验七食品防腐剂抑菌效果的测定
一、实验目的
学习抑菌圈和最低抑制浓度的测定方法，了解防腐剂抑菌效果的测定原理。

二、实验原理
防腐剂抑菌效果的测定方法有两种：平板培养法：抑菌圈（zone of inhibition）试验；液体培养法：最低抑制浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

抑菌圈法即水平扩散法基本原理是在已接种供试菌的琼脂培养基上施以少量抗菌性物质或杀菌剂，使之接触培养基和细菌，经定温培养一定时间后，因药剂的渗透扩散作用，施药部位周围因杀死了细菌而抑制了其在培养基上的生长，从而产生了抑菌圈。

在一定范围内，抑菌圈直径的平方或面积与药剂浓度的对数呈直线函数关系，从而可比较供试样品杀菌活性大小。

其最大优点是精确度高，操作简单，能较快得出结果。

但测定结果受药剂溶解性和扩散能力影响很大，具一定局限性。

根据药剂施加在琼脂培养基表面方式不同，又分为管碟法（牛津杯法）、滤纸片法、孔碟法等，其中以管碟法和滤纸片法应用最广。

本实验主要采用
抑菌圈法进行食品防腐剂抑菌效果比较。

三、实验器材
菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，用牛肉膏蛋白胨培养基培养16~18 h 得到的菌液。

山梨酸钾、苯甲酸钠、双乙酸钠，链霉素。

器材：生化培养箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、酒精灯、平皿、吸管、纸片、镊子、记号笔、尺子等。

四、操作步骤和内容（抑菌圈法）
1、抑菌圈法操作规程
2、每组需配制营养琼脂培养基（100mL）和6 套培养皿，60 支1mL 移液枪头和
盛100mL 蒸馏水（调pH 值）的三角瓶5 个，包扎、121℃灭菌20 min，放在灭菌
锅中保温，注意温度恒定，不要让培养基凝固。

3、将用于试验的防腐剂（抑菌物质）配制成一定的浓度（按国标最大量添加）。

4、将已经培养好的菌悬液制成107cfu/mL 浓度（大肠杆菌OD600=1 时，其菌浓度
为2×109 cfu/mL）的悬浮液，用移液管移取0.1mL 该菌悬液至灭过菌的培养皿中，
倒入15mL 已灭菌的培养基（温度约45℃，用手摸瓶壁不感觉烫手即可），轻轻转
动培养皿，使培养基与菌液混匀，静置凝成平板。

待凝固后，标记。

5、将凝固后的平板用灭菌后的打孔器在标记处平板上打孔（5 个孔洞），并挑出
培养基。

（或将已灭菌的牛津杯依次轻轻放置在标记处平板上）。

按照顺时针方向依次在每个孔洞（或牛津杯）中加入抑菌剂200uL，以无菌水做阴性对照，链霉素作阳性对照，每种抑菌剂的浓度做三个平行样。

6、或用消毒镊子夹取灭菌的圆形滤纸片（直径为6mm）投入到不同浓度药液中，
1min 后取出，放入含细菌的培养基上标记处，每皿放5 片。

或者，或用消毒镊子夹
取灭菌的圆形滤纸片放入含细菌的培养基上标记处，再用移液枪移取 10uL 药液放在滤纸片上，待完全吸收后，再放入培养箱进行培养。

7、 正置于在 37℃下培养箱内，培养 24 h 后，用十字交叉法测量抑菌圈的直径。

五、 实验结果
抑菌圈的大小和图片 六、 注意事项
1、 应在无菌条件下操作，试验完毕后及时灭菌处理。

2、 添加抑菌剂的时候注意不要滴到其他地方，以免影响观察。

3、 操作室温度最好在 28℃左右，以免培养基冷凝过快，无法制作平板。

4、 放滤纸片时要平放、迅速、准确，放下后不能再移动。

附：最低浓度抑制法
1、 操作规程
2、 肉汤培养基与菌悬液（1~2×108CFU/mL ）同上，硫酸庆大霉素（1280IU/mL ）；
3、取出13 支试管，排成一列，标号；
4、加入菌悬液，除第一管加入菌悬液1.8mL 外，其余各管均加入1.0mL；
5、加入倍比稀释的药液：第一管加入药液0.2ml，混匀后，吸出1.0ml 加入到第2 管。

同样方法依次稀释至第12 管，弃去1.0ml，第13 管为生长对照。

12 支试管的药物浓度分别为：128、64、32、1
6、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06 IU/ml。

也可根据实验需要增加试管数，使浓度类推。

6、用棉花塞盖好试管口，置37℃恒温箱培养16~24h。

7、取试管逐支摇匀，肉眼观察，以无细菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度。

实验八酸奶与乳酸菌饮料的制作
一、实验目的
学习乳酸发酵和制作乳酸菌饮料的方法，了解乳酸菌的生长特性。

二、实验原理
酸乳是发酵乳。

所谓发酵乳就是乳和乳制品在特征菌的作用下发酵而成的酸性凝乳状制品，在保质期内该类产品中的特征菌必须大量存在，并能继续存活且具有活性。

因此，酸乳是指在乳中添加乳酸菌（保加利亚杆菌、嗜热链球菌）经乳酸发酵制成的凝乳状产品，成品中必须含有大量的、相应的活性微生物。

酸奶是以牛乳等为原料，其制作原理是通过乳酸菌发酵却经，使牛乳中酪蛋白凝固，同时，形成酸奶独特的香味（与乙醛生成有关）。

酸奶的类型有如下几种：
1．凝固型在添加生产发酵剂后即装入瓶或其他容器内。

移入发酵室内保温发酵而成。

一般可再细分为如几个品种。

（1）全脂与脱脂不含砂糖的酸奶。

（2）全脂与脱脂加砂糖的酸奶。

（3）全脂与脱脂加砂糖、加天然果酱成果汁的酸奶。

( 4 ）高脂加砂糖的酸奶
2．搅拌型添加发酵剂发酵凝固后。

再经搅拌使其成糊状装入瓶或其他容器而成。

可分为以下几个品种：
（1）果味型加入一些草莓、桔子酱或其它天然果汁。

（2）香科型加入一些香草（香兰素）粉或可可粉与巧克力等。

三、实验器材
市销新鲜酸奶。

培养基全脂牛奶或半脱脂牛奶或全脱脂牛奶。

四、操作步骤与内容
1)配奶：在牛奶中添加6% -10%蔗糖后搅匀。

或用奶粉按1:7比例加水配成还原奶，然后
加
6%~10% 蔗糖后搅匀。

2)预热和均质：将原料奶加热至60℃左右，然后在均质机中，于8~10MPa压力下对乳进
行均质处理。

3)消毒：将酸奶原料置于85~90℃下消毒15min；
4)冷却：将消毒后的牛奶冷却至45℃左右；
5)接种：按5%~10 %（V/V）比例将市售优质酸奶作菌种接入冷却牛奶中，充分搅匀；
6)装瓶：将上述牛奶按无菌操作灌入一次性杯中；
7)保温：将接种后的牛奶置于40－42℃的温箱中保温3－4 h（具体时间视凝乳速度而定)；
8)后熟：已形成凝胶态的酸奶放在4℃左右的低温下保持12－24 h ，以使其后熟（后发酵）；
9)品味：评定酸乳质量有理化指标和微生物学指标两类。

本实验中产品的质量以品尝时有
良好的口感和风味为主，同时观察产品的外观，包括凝块状态、色泽洁白度、表层光洁度、无气泡和具有悦入香味等。

相反，若品尝时发现有异味则说明发酵中污染了杂菌。

六、工业化生产工艺
1．工艺流程
2．发酵菌株培养
（1） 将全脂牛乳、半脱脂牛乳或脱脂牛乳(要求新鲜、不含抗生素、产乳牛不患乳房炎）
分装试管。

装量：试管（18cm×l80cm )，10ml/管；三角瓶（500mL)，300ml/瓶。

培养基置于干高温灭菌器内 115℃，15min 灭菌。

生产种子培养需采用较大的容器（如不锈钢桶）。

灭菌则采用常压、85、15min ，连续两次灭菌后牛乳立即冷却待用。

如 1h 内不使用，要储放在 3-5℃环境下。

（2） 将冻干管或液体保藏管菌种接入牛乳试管中活化 2-3 次，至牛乳凝固时，转接于
三角瓶中（母发酵剂），接种量 1-2％左右，生产上还需进行下一级扩大培养（生产发酵剂）．接种量 2％-3 %。

（3） 培养乳酸链球菌 40℃，至牛乳凝固即可，一般培养 12h
保加利亚乳杆菌 42℃，至牛乳凝固即可，一般培养 12h 。

3．原科乳质量要求及灭菌
原料乳质量要求同上述培养基要求。

原料乳可根据产品要求加糖或不加糖，一般加量 5%-8%，最高不超过 10%。

脱脂加糖酸奶是以脱脂乳为原料，高脂加糖酸奶是以在生产前
用稀奶油标准化，使其含脂量不低于60%，果味与香料型酸奶是在发酵前加上水果与可可
浆等。

其工艺流程都一样。

杀菌，将牛乳与砂糖混合，煮沸3min 后过滤。

在不锈钢容器中85℃保温10-15min 杀菌。

4．接种，将保温后的牛乳迅速降温到38-42℃（一般为40℃，夏季38℃，冬季42℃）。

接入发酵剂的量为原料乳量的1％-3％。

采用混合菌株发酵时，总接种量不变，两菌株按等量接种。

5．装瓶，封口，发酵，接种后，装于灭菌牛奶瓶或其他容器中，加盖后送培养箱或发酵室（39±1℃）发酵4-6 小时。

发酵后要随时抽样检查酸度和凝固情况。

当酸度，凝固都达到要求时，停止发酵。

6．酸奶冷却，经检查，酸奶已达到凝固阶段，取出自然冷却1-2h 后，置于2-5℃条件下冷藏。

五、注意事项
1．乳清析出因贮藏温度过高或时间较久，使蛋白质的水合能力降低形成的凝乳疏松而碎裂，使乳清析出。

另外一个原因是牛乳中盐类不平衡。

2．不良、发软的原因可能是：发酵时间不够或使用了发酵能力衰退的发酵剂，产酸低（小
于50o T ) ; 此外，乳中固体物的不足，发酵停止，搬运过程中的剧烈震动等也是造成凝固不良的原因。

3．时间长可能是使用的发酵剂不良，产酸弱，乳中酸度不足，发酵温度过低或发酵剂用量
过少的缘故。

4．滋味及气味不良原料乳、发酵剂的污染以及工艺流程不卫生会使酸乳凝固时出现海绵状
气孔和乳清分离现象，口感不良，有异味。

六、实验结果
产品酸度检测，感官评定七、思考题
1．用发酵剂的目的在于什么？在各种发酵剂的制作中有什么注意事项？
2．乳酸菌发酵制备酸乳的原理？牛乳为什么会凝固？
3．为什么要尽快达到凝乳？如何尽快达到凝乳？
食品微生物实验技能的测评
食品微生物学实验是食品微生物学教学的重要组成部分，对学生实验基本技能的培养，在教学中占有重要的位置。

为了检验学生在经过食品微生物实验课学习后，对食品微生物实验基本技术和知识的掌握程度，并对学生学习效果进行评定。

测评内容包括对食品微生物学实验基本知识和技能的掌握，应用所学知识进行实验设计及系统地完成实验的实际工作能力。

实验1 和实验2 是为此而设计的两种测评方式，可选择其中的一种进行检测。

实验1 基本实验技能的检测
一、实验目的和内容
目的：掌握微生物学的基本实验技能并进行测试。

内容：1．复习全部基本实验操作。

2．教师对基本实验技能进行全面辅导，并接受学生的提问。

3．开放实验室(固定开放时间，学生可自由进入实验室，自己复习和操作)。

二、实验材料和用具细菌、放线菌、酵母菌、霉菌菌种，细菌形态装片；
培养基(液体、斜面、平板)、染色液；。