三种方法建立大鼠腰椎间盘退变模型

《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research
文章编号:2095-4344(2018)16-02514-06 2514
www.CRTER .org
·研究原著·
白荣飞，男，1992年生，山西省吕梁市临县人，汉族，广州中医药大学在读硕士，主要从事中医药治疗脊柱退行性疾病研究。

通讯作者: 张震，博士，医师，广州医科大学附属深圳沙井医院，广东省深圳市 518000
中图分类号:R318 文献标识码:B
稿件接受：2018-03-12
Bai Rong-fei, Master candidate, the Third Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Corresponding author: Zhang Zhen, M.D., Physician, Shajing Hospital of Shenzhen Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China
三种方法建立大鼠腰椎间盘退变模型
白荣飞1，张 震2，林一峰3，原 超3，汪盛玉1，方 胜1，迟立业1 (1广州中医药大学第三临床医学院，广东省广州市 510405；2广州医科大学附属深圳沙井医院，广东省深圳市 518000；3广州中医药大学附属骨伤科医院, 广东省广州市 510240)
DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0221 ORCID: 0000-0002-3939-417X(白荣飞)
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文题释义：
针刺纤维环法：采用21 G 针头全层针刺L 5/6椎间盘纤维环，穿刺深度2.3 mm ，针刺纤维环法是较成熟的造模方法，诱导椎间盘退变效果明确。

终板注射法：在L 5/6椎间盘上下终板采用21 G 穿刺针局部穿刺进针至骨髓腔，加压注入30 μL 无水乙醇。

终板注射法阻断了软骨终板向内层纤维环及髓核的营养渗透，导致其代谢紊乱，其结果符合人椎间盘自然退变过程，对于评估新的椎间盘退变和修复的生物学干预措施有重要意义。

摘要
背景：目前国内外学者对椎间盘退变动物模型进行了大量研究，但尚缺乏公认的最佳实验动物模型，且不同模型之间缺乏系统的比较。

目的：通过针刺纤维环法、终板注射法以及两者联合法建立大鼠腰椎间盘退变模型，比较3种方法的造模效果，为椎间盘退变动物模型的选择提供参考。

方法：SD 大鼠80只，随机等分为4组，分别为针刺组(针刺纤维环)、终板注射组(终板注射无水乙醇)、联合组(即先针刺L 5/6纤维环，再用无水乙醇注射同节段上下终板)以及对照组(假手术对照)。

分别于术后4，8，12周每组各随机抽取3只动物行X 射线检查，测量椎间盘相对高度；取椎间盘组织，行病理学检查及免疫组织化学染色。

结果与结论：①综合X 射线检查、苏木精-伊红染色及免疫组织化学染色结果，除对照组外，针刺组、终板注射组及联合组椎间盘退变均逐渐加重；②术后4周，与对照组相比，终板注射组和联合组椎间盘相对高度明显降低，病理学评分明显升高，Ⅰ型胶原染色平均灰度值显著降低(P < 0.05)；③术后8，12周，与对照组相比，其他3组椎间盘相对高度均明显降低，病理学评分均明显升高，Ⅰ型胶原染色平均灰度值均显著降低(P < 0.05)；与针刺组及终板注射组比较，联合组8周椎间盘相对高度显著降低(P < 0.05)，12周Ⅰ型胶原染色平均灰度值显著降低(P < 0.05)；④结果表明，3种方法均能诱导椎间盘退变；针刺纤维环法手术操作较简单，造模结果可靠，退变严重程度易于控制，可以满足椎间盘退变的各期研究需要；终板注射法适合于椎间盘退变的病因学研究，较针刺纤维环法较早引起退变，但二者诱导退变程度在后期基本相同；联合法较单一方法可明显加快并加重椎间盘退变，有效缩短实验周期。

关键词：
椎间盘退变；大鼠；动物模型；纤维环穿刺法；终板注射法；组织构建 主题词：
椎间盘退化；模型，动物；组织工程 基金资助：
国家自然科学基金项目(81574000)
Bai RF , Zhang Z, Lin YF , Yuan C, Wang SY, Fang S, Chi LY. Establishing a rat model of intervertebral disc degeneration using three methods.
Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2018;22(16):2514-2519. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0221
P .O. Box 10002, Shenyang 110180
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Establishing a rat model of intervertebral disc degeneration using three methods
Bai Rong-fei 1, Zhang Zhen 2, Lin Yi-feng 3, Yuan Chao 3, Wang Sheng-yu 1, Fang Sheng 1, Chi Li-ye 1 (1the Third Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 2Shajing Hospital of Shenzhen Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China; 3Orthopedic Hospital Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510240, Guangdong Province, China)
Abstract
BACKGROUND: Numerous studies focus on animal models of intervertebral disc degeneration (IDD), but criteria for establishing the animal models of IDD have not been confirmed, and there is a lack of systematic comparison among models.
OBJECTIVE: To compare the rat models of IDD established by puncturing at annulus, endplate injection and their combination, thus providing reference for IDD model selection.
METHODS: Eighty Sprague-Dawley rats were equivalently randomized into four groups: puncturing group (puncturing at the annulus),
endplate injection group (endplate injected with ethyl alcohol), combination group (puncturing at the L 5-6 annulus and endplate injection at the same segment) and sham operation group. Three rats in each group were taken at postoperative 4, 8, and 12 weeks for X-ray examination to measure the disc height; and the discs were removed for histological observation and immunohistochemical staining.
RESULTS AND CONCLUSION: The results of X-ray examination, hematoxylin-eosin staining and immunohistochemical staining all showed that the IDD degree was gradually aggravated in all groups except the sham operation group. At postoperative 4 weeks, compared with the sham operation group, in the endplate injection and combination groups, the percent disc height was significantly decreased, the pathological scores were significantly increased and the average gray value of collagen type I was significantly reduced (P < 0.05). At postoperative 8 and 12 weeks, compared with the sham operation group, the percent disc height in the other three groups were all significantly decreased, the pathological score was significantly increased, and the average gray value of collagen type I was significantly decreased (P < 0.05). Compared with the puncturing and endplate injection group, in the combination group, the percent disc height at postoperative 8 weeks was significantly decreased, and the average gray value of collagen type I at postoperative 12 weeks was significantly decreased (P < 0.05). These results suggest that the rat IDD model can be successfully constructed by above three methods. Puncturing at the annulus is easy to operate and control IDD progression, which can be used to study different stages of IDD. Endplate injection is suitable for the etiological study of IDD, and induces IDD earlier than puncturing, but the final results are similar. The combination method can significantly accelerate IDD aggravation, and thus is not time consuming. Subject headings: Intervertebral Disk Degeneration; Models, Animal; Tissue Engineering Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81574000
0 引言 Introduction
由椎间盘退变(intervertebral disc degeneration ，IDD)引起的疾病称为椎间盘退变性疾病，包括颈椎病、腰椎间盘突出症、退变性脊柱侧弯症等一系列临床常见的脊柱病，是临床常见病和多发病。

据统计，有40%的腰腿痛患者是由椎间盘退变引起[1]，腰痛已经成为影响人们工作以及就医的首要原因，并给社会造成巨大经济负担[2]。

目前关于椎间盘退变的具体病理过程仍不确切[3]，因此，只有建立有效、可靠的椎间盘退变动物模型作为实验载体，才能够更为深入地探究椎间盘退变的影响因素、发病机制以及各种治疗方法的有效性。

现己建立的各类动物模型主要有改变力学模型、椎间盘损伤模型及其他模型。

其中椎间盘损伤动物模型是采用手术方式对纤维环、髓核或终板进行损伤，造成相应的病理改变，进而造成椎间盘退行性变，多属实验诱发性退变模型，目前应用广泛[4]。

但目前对不同手术损伤方式诱导的退变模型之间进行比较的研究较为缺乏，对于椎间盘退变模型的选择仍有许多争议[5]。

实验分别采用纤维环针刺法与终板注射法及两者的联合法建立椎间盘退变动物模型，并通过影像学检查、病理及免疫组织化学染色方法进行观察和比较，以期为椎间盘退变的相关研究中动物模型的选择提供参考，为后期研究椎间盘退变的临床治疗提供可靠科研平台。

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年4月至10月在广州中医药大学实验动物中心完成。

1.3 材料 健康4月龄雄性SPF 级SD 大鼠80只，体质量(250±20) g ，由广州中医药大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：SYXK[粤]2013-0001。

标准条件下适应性饲养1周。

1.4 实验方法
1.4.1 分组及造模 将实验动物按体质量分层随机法分为针刺纤维环组(针刺组)、终板注射组、联合组以及对照组4组，每组20只动物。

所有动物术前1 d 禁食水，称体质量并计算麻醉剂量，以体积分数7%水合氯醛0.5 mL/kg 腹腔注射全麻。

待疼痛反应消失后，腹部剃毛备皮约6 cm× 4 cm ，大鼠取仰卧位，用乙醇消毒后铺一次性手术单，取右侧旁正中切口，依次切开皮肤、皮下组织，打开腹腔，剪开后腹膜，暴露L 5/6椎间盘和终板，然后针刺组用21 G 微量穿刺针以针头帽制作的套筒为保护装置，对以上椎间盘节段穿刺，平行于软骨终板进针，进针深度为纤维环全层针刺(控制刺入深度为
2.3 mm)[6-7]；终板注射组采用21 G 穿刺针在距L 5/6椎间盘上下软骨终板2.0-
3.0mm 处局部穿刺进针至骨髓腔内，然后连接1 mL 注射器针管通过加压作用匀速缓慢注入30 μL 无水乙醇，保持30 s 后出针；联合组依次进行上述两项操作。

操作完成后依次缝合皮下筋膜及皮肤。

而对照组实验动物直接缝合皮下筋膜及皮肤。

1.
4.2 术后处理 术后放入单笼饲养，术后连续3 d 每只大鼠给予青霉素8×104 U 肌注抗感染，观察实验动物下肢活动
白荣飞，张震，林一峰，原超，汪盛玉，方胜，迟立业. 三种方法建立大鼠腰椎间盘退变模型[J]. 中国组织工程研究，2018，22(16):2514-2519. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0221
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
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情况、穿刺切口愈合情况以及死亡情况。

1.5 主要观察指标
1.5.1 X 射线摄片检查 术后第4，8，12周每组各随机取3只大鼠，在体积分数7%水合氯醛腹腔麻醉下右侧卧位进行X 射线检查，据Kim 等[8]提出的“三中线法”，测得手术节段L 5/6椎间盘高度值为X ，相邻节段L 4/5的椎间盘高度值为Y ，则X 与Y 的比值即为手术节段椎间盘的相对高度H 。

所有影像结果请高年资影像科医师行单盲评估。

1.5.2 组织病理学检测 以上实验大鼠行X 射线检查后安乐处死，迅速完整截取第5，6腰椎及其间的椎间盘组织，用尖刀沿白色的骨性终板边缘平行于终板方向完整截取椎间盘组织，用无菌生理盐水冲洗血迹，体积分数40 g/L 的多聚甲醛溶液固定24 h ，石蜡包埋，以4 μm 厚度切片连续横断面切片，每个标本至少选取2片髓核与纤维环组织较完整的切片进行苏木精-伊红染色。

用光学显微镜观察，按照Masuda [9]椎间盘病理组织形态学分级进行评价。

1.5.3 免疫组织化学检测 选取上述石蜡切片的椎间盘组织，用二甲苯脱蜡，逐级乙醇水化；滴加按1∶100比例配制好的Ⅰ型胶原一抗，阴性对照切片则滴加PBS ；在 4 ℃孵育过夜，用辣根过氧化物酶一生物素标记的二抗孵育；DAB 显色，边显色边观察。

苏木精复染，中性树胶封固。

在光学显微镜下观察，髓核细胞或纤维细胞周围基质染色呈棕黄色者为阳性，无染色者为阴性，针对每张切片中央髓核区域随机选取4个高倍视野，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件计算其灰度值(灰度值越小说明蛋白的表达越好)，取均值进行统计学分析。

1.6 统计学分析 实验数据用SPSS 2
2.0统计学软件处理。

计量资料采用单因素方差分析，用SNK 法进行组间比较；非参数资料采用秩和检验比较各组间的统计学差异； P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果 Results
2.1 实验动物数量分析 针刺组、终板注射组各有1只大鼠因麻醉意外死亡；联合组2只大鼠因术中误伤腹主动脉导致大出血死亡，1只因术后感染死亡。

术后各时间点在剩余75只大鼠中随机每组选取3只进行各项指标检测，并进入结果分析。

2.2 X 射线检查结果 除对照组外，针刺组、终板注射组及联合组手术节段的椎间隙随时间延长均逐渐降低，上下软骨终板出现不同程度钙化，椎体边缘骨赘形成(图1)，各期大鼠椎间盘高度相对值见表1。

术后4周，与对照组相比，针刺组椎间盘相对高度下降不明显(P > 0.05)，而终板注射组和联合组则均明显降低(P < 0.05)。

术后8周，针刺组、终板注射组及联合组椎间盘相对高度较对照组均有明显降低(P < 0.05)；且针刺组、终板注射组及联合组之间比较也都存在明显差异(P < 0.05)。

术后12周，与对照组比较，针刺组、终板注射组及联合组椎间盘相对高度均存在明显差
异(P < 0.05)，但针刺组、终板注射组之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

以上结果说明纤维环针刺法比终板注射法造成椎间隙高度下降的速度更慢，但最终下降程度无明显差异。

2.3 椎间盘苏木精-伊红染色结果 对照组各个时间点无明显差异，椎间盘髓核完整，中央髓核呈类圆形，可见大量脊索细胞及少量类软骨细胞，外周纤维环组织环形排列，与髓核分界清晰；而针刺组、终板注射组及联合组椎间盘髓核及纤维环随时间推移退变呈逐渐加深趋势，纤维环内
层纤维扭曲，向椎间盘凸入，与髓核分界不清，髓核内出现裂隙，脊索细胞被纤维软骨细胞替代，可见炎性细胞浸润(图2)。

各组椎间盘组织病理评分见图3，对照组术后各时间点评分无明显差异，而针刺组、终板注射组及联合组差异明显(P < 0.05)；术后4周，与对照组相比，终板注射组及联合组椎间盘组织病理评分显著升高，而针刺组升高不明显；术后8周，针刺组、终板注射组及联合组椎间盘病理评分较对照组均显著升高(P < 0.05)，且针刺组、终板注射组及联合组之间比较也都存在明显差异(P < 0.05)；术后12周，针刺组、终板注射组及联合组椎间盘病理评分较对照组均明显升高(P <0.05)，而针刺组、终板注射组之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 免疫组织化学染色结果 术后各时间点，对照组椎间盘纤维环外层Ⅰ型胶原染色呈强阳性，纤维环内层染色较弱，髓核中几乎无染色；随着造模时间的延长，针刺组、终板注射组及联合组椎间盘髓核Ⅰ型胶原染色逐渐增强，终板注射组及联合组术后4周即可见髓核呈淡黄色，术后8周髓核染色加深，呈黄色，术后12周则呈棕黄色；而针刺组术后8周髓核呈淡黄色，术后12周呈黄色(图4)。

4组各时间点Ⅰ型胶原免疫组织化学染色平均灰度值见表2。

统计学分析发现，在同一组内不同时间点比较中，对照组各时间点结果差异无显著性意义(P > 0.05)，而针刺组、终板注射组及联合组结果差异均有显著性意义(P < 0.05)，提示3种方法均可使椎间盘髓核内Ⅰ型胶原表达增多。

在术后4周，与对照组相比，针刺组Ⅰ型胶原染色平均灰度值降低不明显(P > 0.05)，而终板注射组及联合组则明显降低(P < 0.05)，表明术后4周时，纤维环针刺尚未引起髓核内Ⅰ型胶原表达明显增多，而终板注射法及联合法则
表1 造模后不同时间点各组大鼠的椎间盘高度 (x _
±s ，相对值)
Table 1 Disc height of the rats in each group at different time points after modeling 表注：与对照组比较，a P < 0.05；与联合组比较，b P < 0.05；与终板注射组比
较，c P < 0.05。

组别 4周 8周 12周 针刺组
0.90±0.05 0.81±0.05abc 0.70±0.02a 终板注射组
0.70±0.07a 0.67±0.09ab 0.65±0.05a 联合组 0.63±0.05a 0.51±0.03a 0.50±0.04a 对照组 0.97±0.02
0.96±0.03
0.95±0.03
Bai RF , Zhang Z, Lin YF , Yuan C, Wang SY, Fang S, Chi LY. Establishing a rat model of intervertebral disc degeneration using three methods.
Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2018;22(16):2514-2519. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0221
P .O. Box 10002, Shenyang 110180
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in
图1 造模后8周各组大鼠腰椎X 射线片(箭头示手术节段L 5/6椎间盘)
Figure 1 X-ray radiographs of the rat lumbar vertebrae in each group at postoperative 8 weeks after modeling (arrows indicate surgical L 5-6 segments) 图注：针刺组(A)、终板注射组(B)以及联合组(C)X 射线可见椎间隙不同程度变窄，上下终板骨质硬化，椎体边缘骨赘形成，而对照组(D)未见明显变化。

图注：图中A 为针刺组，A1显示纤维环出现层离裂隙，细胞排列紊乱；A2可见髓核细胞紊乱，出现轻度纤维化；B 为终板注射组，B1显示纤维环中度扭曲伴裂隙形成；B2可见髓核细胞减少，纤维化明显；C 为联合组，C1可见纤维环重度扭曲，排列松散；C2显示髓核细胞稀少，基
本纤维化；D 为对照组，D1显示纤维环排列有序；D2为髓核细胞排列有序，可见较多脊索细胞。

病理学评分
针刺组 终板注射组 联合组 对照组
4周 图3 各组椎间盘组织病理评分结果
Figure 3 Pathological scores of the intervertebral disc in each group 表2 造模后不同时间点各组大鼠Ⅰ型胶原染色灰度值(x _
±s ，相对值)
Table 2 Average grey value of collagen type I in rat intervertebral disc in each group at different time points after modeling
表注：除对照组外，其他3组4，8，12周灰度值依次变小(说明Ⅰ型胶原表达
逐渐增多)；与对照组比较，a P < 0.05；与联合组比较，b P < 0.05。

组别
4周
8周
12周
针刺组 177.84±2.23 173.46±1.55a 168.70±2.06ab 终板注射组 175.67±1.37a 169.95±1.43a 165.78±1.93ab 联合组 173.89±1.65a 167.51±1.26a 160.90±2.04a 对照组
180.33±2.11
178.96±2.53
176.75±3.02
图4 造模后8周各组椎间盘Ⅰ型胶原免疫组织化学染色(×400)
Figure 4 Immunohistochemical staining of collagen type I in rat intervertebral disc in each group at postoperative 8 weeks after modeling (×400) 图注：图A 为针刺组髓核Ⅰ型胶原染色，可见髓核区染色呈阳性(黄色)；B 为终板注射组，髓核细胞稀少，可见染色呈阳性(黄色)的纤维软骨细胞；C 为联合组，髓核细胞染色呈强阳性(棕黄色)；D 为对照组，髓核细胞基本无染色。

图2 术后8周各组椎间盘病理苏木精-伊红染色(×400) Figure 2
Hematoxylin-eosin
staining results of the rat intervertebral disc in each group at postoperative 8 weeks after modeling (×400)
白荣飞，张震，林一峰，原超，汪盛玉，方胜，迟立业. 三种方法建立大鼠腰椎间盘退变模型[J]. 中国组织工程研究，2018，22(16):2514-2519. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0221
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
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能使Ⅰ型胶原表达明显增多。

在术后8周，4组Ⅰ型胶原染色平均灰度值比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。

术后12周，针刺组、终板注射组及联合组Ⅰ型胶原染色平均灰度值与对照组相比均明显降低(P < 0.05)，而联合组又明显低于另外两组(P < 0.05)，针刺组与终板注射组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

以上结果提示3种方法均可使Ⅰ型胶原在椎间盘髓核内表达明显增多，标志着椎间盘不同程度的退变，纤维环针刺法术后8周才造成明显的椎间盘退变，但其与终板注射法所引起的椎间盘退变程度在术后12周差异不明显。

3 讨论 Discussion
椎间盘退变是一个复杂的过程，是在包括自然因素、环境因素等多种因素共同作用下逐渐形成的[10]，近年来，由于腰痛对个人、家庭以及社会造成的负担日益加重，所以关于椎间盘退变的病因及发病机制的研究一直是个热点。

大量临床前实验研究表明，椎间盘退变机制可能是椎间盘组织的营养供应减少、椎间盘细胞外基质成分改变、细胞过度凋亡、生物力学改变、自身免疫等因素共同导致的一种复杂的病理现象，而其确切机制尚未阐明
[3，11-12]。

因此建立可靠的椎间盘退变动物模型对相关研究是非常重要的，良好的椎间盘退变动物模型要求与人类的椎间盘退变具有相似性和可比拟性，所选动物解剖和生理特点应尽可能与人类相似，模型重复性好，能再现椎间盘退变的客观规律。

然而目前已报道的各种动物模型虽各有优点，但每一种都不能完美契合以上要求，这就需要通过比较来进行选择，考虑到动物数量，经济条件。

目前研究应用最广泛的是以鼠或兔制作的诱发性椎间盘退变模型[13]。

纤维环穿刺法是一种较为成熟的造模方式，多数学者更倾向于行开放手术，采用21 G 微量穿刺针并将穿刺深度控制在2.3 mm [5]，这种方法能有效损伤纤维环但不会造成髓核组织的过度丢失，椎间盘损伤后随着时间的进展而缓慢退变，可以稳定地诱导椎间盘退变，其机制可能为纤维环的破损造成椎间盘突出，水分丢失，然后髓核组织压力及微环境改变，既而发生变性，其退变过程慢，所需时间为4-8周[14-15]。

软骨终板是椎间盘主要营养供应途径，约占正常椎间盘营养的80%，诸如水、胶原及蛋白多糖等营养成分都由此通道传递。

Yuan 等[16]研究表明，通过向大鼠尾椎体内终板下注入无水乙醇，可引起终板供血障碍，椎间盘失去营养供应，最终导致椎间盘发生退变，此种方法造模术后4周即可观察到明显的椎间盘退变。

通过腰椎X 射线片上测量椎间隙高度改变及骨质改变，进而推测椎间盘的变化，可初步判断椎间盘退变的严重程度，此方法广泛应用于椎间盘退变动物实验研究中，研究证实其与病理学、免疫组织化学检测有较高的一致 性[17]。

在椎间盘退变过程中，椎间盘纤维环、髓核组织结构以及胶原蛋白成分会发生改变，这种变化可通过病理染
色及免疫组织化学染色法观察。

其中苏木精-伊红染色操作简便，能显示椎间盘各层组织结构及其变化，是研究椎间盘组织形态的重要技术。

免疫组织化学染色作为分子生物学研究的常规技术，可以定量地分析腰椎椎间盘内各种生化物质的改变，正常的腰椎椎间盘含有大量胶原蛋白，其中Ⅰ型胶原蛋白只存在于正常椎间盘外层纤维环中，构成支架结构，起到保护髓核组织、维持椎间盘高度的作用，而正常的髓核组织几乎不表达。

最近的一项遗传学研究表明，Ⅰ型胶原蛋白基因多态性可能是中国汉族老年人群椎间盘退变的危险因素[18]，另动物实验研究发现，髓核及纤维环中Ⅰ型胶原蛋白的表达在腰椎椎间盘发生退变后明显增加，且退变越严重，髓核纤维化程度越高，Ⅰ型胶原蛋白的表达升高越明显[19]，因此髓核中Ⅰ型胶原蛋白表达的升高是椎间盘退变的重要标志。

本研究首次采用终板注射无水乙醇法处理大鼠腰椎间盘，并结合经典的纤维环穿刺法，分3个时间点对比观察其退变情况，综合影像学、病理及免疫组织化学检测结果表明，3种造模方法处理后的相应椎间隙随时间延长均逐渐降低，同时伴有软骨终板钙化、椎体边缘骨赘形成，纤维环结构紊乱，髓核组织脱水，髓核内Ⅰ型胶原蛋白表达明显增多，提示3种造模方法均能不同程度地诱导椎间盘退变，但又各有特点，总结如下：
联合法较单一方法同期可造成更严重的椎间盘退变；针刺纤维环法致退变进展缓慢，术后8周才观察到明显退变，而与之相比，终板注射法能更早引起退变，但后期两者均可造成椎间盘重度退变，各指标对比差异不明显，其原因可能是椎间盘重度退变时，椎间隙明显变窄，髓核大面积缩小，组织基本纤维化，故其椎间盘高度、组织结构及细胞外基质胶原蛋白含量变化不明显。

实际上，在椎间盘退变过程中，除了椎间盘高度、组织结构、Ⅰ型胶原蛋白成分发生改变外，髓核区的Ⅱ型胶原蛋白、蛋白多糖、转化生长因子等的含量以及各种基因的表达在退变各期亦发生变化[20-21]，另外椎间盘组织退变早期含水量的改变可通过MRI 检查进行准确评价[22]。

作者在实验中，没有进行磁共振及其他分子生物学的检测，此为本研究的不足之处。

综上所述，联合法较单一方法可明显加快并加重椎间盘退变过程，有效缩短实验周期，提高效率，但其对实验动物创伤大，对操作要求高；针刺纤维环法手术操作较成熟，结果可靠，易于控制，无需特殊的实验设备，可以选用不同型号的穿刺针及不同的穿刺深度，从而达到理想的造模程度，以满足椎间盘退变的各期研究需要；终板注射无水乙醇法不直接损伤椎间盘，而是阻断了软骨终板向内层纤维环及髓核的营养渗透，导致其代谢紊乱，其结果符合人椎间盘自然退变过程，此法适合于椎间盘退变的病因学研究，且对于评估新的椎间盘退变和修复的生物学干预措施也有重要意义。

Bai RF , Zhang Z, Lin YF , Yuan C, Wang SY, Fang S, Chi LY. Establishing a rat model of intervertebral disc degeneration using three methods.
Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2018;22(16):2514-2519. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0221
P .O. Box 10002, Shenyang 110180
2519
致谢：感谢导师原超教授的教导，感谢广州中医药大学岭南医学研究中心詹冬香老师给予的帮助。

作者贡献：白荣飞、张震进行实验设计，实验实施为白荣飞、张震、汪盛玉，资料收集为白荣飞，白荣飞成文，林一峰、原超评估并审校，
经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金项目(81574000)”的资助。

所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程，没有因其岗位角色影响文章观点和对数据结果的报道，不存在利益冲突。

伦理问题：实验方案经广州中医药大学动物实验伦理委员会审查批准。

实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。

实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。

文章的撰写与编辑修改后文章遵守了《动物实验体内实验研究报告规范指南》(ARRIVE 指南)。

文章查重：文章出版前已经过CNKI 反剽窃文献检测系统进行3次查重。

文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。

作者声明：第一作者和通讯作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。

论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。

文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

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4 参考文献 References
[1]
Colombier P ,Clouet J,Hamel O,et al. The lumbar intervertebral disc: From embryonic development to degeneration.Joint Bone Spine.2014;81(2):125-129.
[2]
Pranjić N, Maleš-Bilić L.Low back pain at new working
ambient in era of new economy: a systematic review about occupational risk factors.Acta Medica Croatica Casopis Hravatske Akademije Medicinskih Znanosti.2015;69(1):49. [3]
de Campos MF,de Oliveira CP ,Neff CB,et al.Studies of molecular changes in intervertebral disc degeneration in animal model. Acta Ortop Bras.2016;24(1):16-21.
[4] 马晟,贾育松,孙旗.体内腰椎间盘退变动物模型的研究与进展[J].中国组织工程研究,2017, 21(11):1790-1797.
[5]
Sun F,Qu JN,Zhang YG .Animal models of disc degeneration and major genetic strategies.Pain Physician.2013;16(3): E267-E275.
[6] 崔力扬,刘尚礼,丁悦,等.大鼠腰椎间盘针刺退变模型的建立[J].中国矫形外科杂志, 2007, 15(13):1008-1011.
[7]
Silveira JW,Issy AC,Castania VA,et al.Protective effects of cannabidiol on lesion-induced intervertebral disc degeneration. Plos One.2014;9(12):e113161.
[8]
Kim KS,Yoon ST,Li J,et al.Disc degeneration in the rabbit: a biochemical and radiological comparison between four disc injury models.Spine.2005;30(1):33-37.
[9]
Masuda K,Aota Y ,Muehleman C,et al.A novel rabhit model of mild, reproducihle disc degeneration by an anulus needle puncture: correlation between the degree of disc injury and radiological and histological appearances of disc degeneration.Spine(Phila Pa 1976).2005;30(1):5-14.
[10] Jin L,Balian G ,Li XJ.Animal models for disc degeneration-an update.Histol Histopathol.2017:119110.
[11]
Tao-Tao XU,Fei L,Jin HT,et al.Research advance on
intervertebral disc degeneration and cell death. Zhongguo Gu Shang.2015;28(7):673-678.
[12]
Vergroesen PP ,Kingma I,Emanuel KS,et al.Mechanics and biology in intervertebral disc degeneration: a vicious circle. Osteoarthritis Cartilage.2015;23(7):1057-1070.
[13]
Liu B,Zhang L,Tian F,et al.[Progress in disc degeneration models and calcitonin therapy]. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi.2014;28(8):1051-1054.
[14]
Moss IL,Zhang Y ,Shi P ,et al.Retroperitoneal approach to the intervertebral disc for the annular puncture model of
intervertebral disc degeneration in the rabbit.Spine J.2013; 13(3):229-234.
[15]
Martin JT,Gorth DJ,Beattie E E, et al.Needle puncture injury causes acute and long-term mechanical deficiency in a mouse model of intervertebral disc degeneration. J Orthop Res.2013;31(8):1276-1282.
[16]
Yuan W,Che W,Jiang YQ,et al.Establishment of Intervertebral Disc Degeneration Model Induced by Ischemic Sub-Endplate in Rat Tail.Spine J.2015;15(5):1050-1059.
[17]
Issy AC,Castania V,Castania M,et al.Experimental model of intervertebral disc degenerationby needle puncture in Wistar rats.Braz J Med Biol Res. 2013 ;46(3):235-244.
[18]
Lin P ,Fu Q.[Association of collagen type I alpha1 Sp1
polymorphism with intervertebral disc degeneration in Han elderly people].Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2014; 45(1):62-65.
[19]
Chen CH,Chiang CJ,Wu LC,et al.Time Course Investigation of Intervertebral Disc Degeneration in a Rat-tail Puncture Model.Life Sciences.2016;156:15-20.
[20]
Young-Joon K. A Minimally Invasive Rabbit Model of
Progressive and Reproducible Disc Degeneration Confirmed by Radiology, Gene Expression, and Histology. J Korean Neurosurg Soc.2013;53(6):323-330.
[21]
Sivan SS,Wachtel E,Roughley P .Structure,function,aging and turnover of aggrecan in the intervertebral disc.BBA - General Subjects.2014;1840(10):3181-3189.
[22]
Wang W, Hou J, Lv D, et al. Multimodal quantitative magnetic resonance imaging for lumbar intervertebral disc degeneration. Exp Ther Med.2017;14(3):2078-2084.。