p—STAT3 与HER2在乳腺癌分子亚型中表达的相关性分析

p—STAT3 与HER2在乳腺癌分子亚型中表达的相关性分析
目的探讨p-STAT3（磷酸化的信号转导和转录激活因子3）及人类表皮生长因子受体-2（HER2）在乳腺癌分子亚型中的表达及其相关性。

方法根据Nielsen 标准进行分子分型的59例乳腺癌组织切片，应用免疫组化技术检测p-STAT3及HER2的表达水平。

结果在乳腺癌各分子亚型中，p-STAT3均有表达，且可观察到p-STAT3在细胞核内的定位。

在腺腔A型、腺腔B型、HER2过表达型、基底样型乳腺癌中，p-STAT3的表达率分别为21.42%、83.33%、83.33%、66.67%，p-STAT3与HER2在乳腺癌分子亚型中的表达水平呈正相关关系（r=0.452，P＜0.01）。

结论p-STAT3与HER2在乳腺癌分子亚型中的表达水平呈正相关关系。

标签：乳腺癌；分子分型；免疫组织化学；p-STAT3；HER2
乳腺癌是近年来发病率持续增高的女性恶性肿瘤，其高度异质性导致临床预后的多态性。

近年来，不少学者根据分子基因的表达，将乳腺癌分类成不同的亚型[1]：Luminal亚型（ER/PR+）、HER2过表达型（ER-、PR-、HER2+）、Basal-like （ER-、PR-、HER2-）型和Normal-like型，并发现不同分子亚型乳腺癌的预后有显著差异[2]。

HER2是原癌基因CerB2编码的具有受体酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，属表皮生长因子受体家族，与肿瘤形成密切相关[3]，过表达HER2乳腺癌的侵袭性增强[4]。

STAT3作为HER2的下游分子，是信号转导和转录激活因子家族（signal transducer and activator of transcription，STATs）中重要成员，已被确定为癌基因[5]，因其本身及其磷酸化形式（p-STAT3）在多种肿瘤组织和细胞系中持续激活和异常表达，转移及血管生成有关[6]，且p-STAT3可促进抗凋亡基因的表达，有拮抗某些化疗药物的作用，其与乳腺癌的相关性研究成为近年来恶性肿瘤信号通路研究的热点[7]。

在乳腺癌的分子亚型中，HER2的过表达是否伴随着p-STAT3的高表达即二者的相关性研究尚无文献报道，因此本实验拟通过检测p-STAT3在乳腺癌组织各分子亚型中的表达情况，并分析其与组织中HER2表达的相关性，探讨STAT3是否可作为乳腺癌分子分型的补充，为乳腺癌患者的分子靶向治疗提供帮助。

1 资料与方法
1.1一般资料收集2012年9月～2013年9月徐州医学院附属医院病理科有完整切片和石蜡档案及病历资料的浸润性乳腺癌病例59例及乳腺纤维腺瘤病例10例，其中乳腺癌腺腔A型14例，腺腔B型15例，基底样型13例，HER2过表达型17例。

试剂：兔抗人p-STAT3抗体及兔抗人HER2抗体购自美国EPITOMICS公司。

MaxVision快速法试剂盒、柠檬酸盐缓冲液等试剂购自迈新公司。

1.2 方法
1.2.1免疫组织化学法检测p-STAT3表达p-STAT3抗体1：200浓度稀释，室温静置备用。

主要实验步骤：①脱水：65°C 烤箱中干烤30 min；②脱蜡：二
甲苯I中浸泡15 min，之后二甲苯II中浸泡15 min；⑴在无水乙醇I、无水乙醇II、95%酒精、80%酒精、70%酒精中分别浸泡各5 min；⑵双蒸水中浸泡5 min；
③微波修复抗原：将切片浸入枸橼酸修复液，先高火2 min将沸未沸时转至低火，持续约5 min；⑴室温下PBS洗涤5 min×3次；⑵3%双氧水室温孵育5-10 min；
⑶室温下PBS洗涤5 min×3次；④封闭：滴加正常羊血清封闭液（A试剂），37°C 孵育10-15 min；⑴滴加p-STAT3一抗，37°C 2-3h，后室温下PBS洗涤5 min×3次；⑵滴加二抗（B试剂），37°C ，30 min，室温下PBS洗涤5 min×3次；⑶滴加C试剂，37°C ，30 min，室温下PBS洗涤5 min×3次；⑤DAB显色：滴加新鲜配置单DAB显色液，室温下放置3-10 min，至显棕色为止，蒸馏水终止反应，并洗涤；⑥苏木素复染，3-4 min后流水冲洗；⑦分化：1%盐酸酒精中浸泡1-2 s 后流水冲洗；⑧蓝化：氨水中浸泡30s-1 min后流水冲洗；⑴脱水；⑵透明；⑶中性树胶封片，显微镜下观察。

1.2.2免疫组织化学法检测HER2表达兔抗人HER2抗体按预实验结果1：200稀释，室温静置备用。

步骤同”免疫组织化学法检测p-STAT3表达状况”。

1.3结果判断
1.3.1组织p-STAT3表达水平的结果判定免疫组化染色结果根据阳性细胞的数量和染色深度综合判断，以细胞浆和/或细胞核中出现清晰棕黄色颗粒为阳性细胞。

参照文献[8]按3分制计分：0，阴性或阳性细胞数10%的浸润癌细胞呈现弱至中等强度、完整但不均匀的细胞膜棕黄着色或30%的浸润癌细胞呈现强的、完整的细胞膜棕褐着色。

IHC法HER2-/+者判定为HER2阴性；HER2++、+++者判定为HER2阳性。

以上结果均由两位高年资的病理科医生评估。

1.4统计学分析实验结果用SPSS13.0软件进行统计分析，采用Spearman相关分析对所得数据进行统计学处理。

P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果
根据乳腺癌ER、PR、HER2的不同表达情况将乳腺癌分为Luminal A型，Luminal B型，HER-2（+）型，basal-like型，采用上述四种分子分型的乳腺癌组织及乳腺纤维腺瘤组织，通过免疫组织化学技术观察p-STAT3、HER2的蛋白表达情况。

IHC结果示p-STAT3蛋白主要分布在细胞核内（图H），HER2蛋白主要定位于细胞膜上（图E），在乳腺纤维腺瘤中HER2及p-STAT3蛋白的表达均呈阴性（图A、B）；在乳腺癌各分子亚型中的表达情况分别如下图中所示。

3 讨论
近年来乳腺癌信号转导途径在肿瘤细胞中抗凋亡和促进分化增殖的作用越来越受到重视，其中，信号传导转录活化蛋白家族途径的研究尤为突出。

有超过40种的细胞外多肽物质可以与细胞表面的特异性受体结合，从而引发胞浆内STATs的活化。

迄今为止，在哺乳动物中发现的STAT家族包括7个成员，它们广泛表达于不同类型的细胞和组织中，参与细胞的生长、恶性转化及凋亡等功能的调控。

STAT3作为STATs的重要成员，可以通过直接或间接调控相关基因的表达，在细胞增殖、凋亡、分化和血管生存等方面发挥着重要作用，并在多种肿
瘤中异常表达，例如：白血病、非小细胞肺癌、前列腺癌、肝癌等[9，10]。

在某些细胞外因子作用下，STAT3磷酸化激活，通过SH2结构域形成二聚体，进入细胞核后发挥转录调控作用，实验中我们观察到p-STAT3主要定位于乳腺癌细胞的细胞核内（图H），与文献报道相一致；生理状态下，细胞中STAT3的激活短暂，但在恶性肿瘤细胞中STAT3被持续激活，这也与我们上述实验结果相符合（图H）。

有研究显示，乳腺癌p-STAT3的表达较乳腺良性病变显著增高，这与我们实验中所观察到的结果相符，并且其表达与乳腺癌的瘤体大小、淋巴结转移密切相关，提示p-STAT3在乳腺癌的生长、侵袭等恶性演进过程中发挥重要作用[11]。

Horiguchi等[12]通过免疫组化分析认为p-STAT3的高表达与肾癌的发生发展、预后等密切相关。

本实验通过检测术后乳腺癌组织各亚型中HER2及p-STAT3的表达情况，分析二者的相关性，得出二者在各亚型中呈正相关关系，表明HER2在亚型中的表达情况与p-STAT3的表达情况近似一致，初步认为p-STAT3可补充现有的乳腺癌分子分型，且HER2很可能通过激活p-STAT3引起乳腺癌的恶性生物学行为。

参考文献：
[1]Perou CM，Sorlie T，Eisen MB，et al. Molecular portraits of human breast tumours[J].Nature，2000，406（6797）：747-752.
[2]连臻强，何洁华，王曦，等. 乳腺癌不同分子亚型的临床特点和生存分析[J]. 中华乳腺病杂志（电子版），2009，3（2）：5-9.
[3]Ludovini V，Gori S，Colozza M，et al. Evaluation of serum HER2 extracellular domain in early breast cancer patients：correlation with clinicopathological parameters and survival[J].Annals of oncology，2008，19（5）：883-890.
[4]吴凡，叶韵斌，陆俐丽，等. 乳腺癌患者血清HER2 的检测及其临床意义[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志，2009，16（4）：405-409.
[5]Kong L Y，Wei J，Sharma AK，et al. A novel phosphorylated STAT3 inhibitor enhances T cell cytotoxicity against melanoma through inhibition of regulatory T cells[J].Cancer immunology，immunotherapy，2009，58（7）：1023-1032.
[6]Huang S. Regulation of metastases by signal transducer and activator of transcription 3 signaling pathway：clinical implications[J].Clinical Cancer Research，2007. 13（5）：1362-1366.
[7]张文，王雅杰.STAT3 与乳腺癌的研究进展[J]. 现代肿瘤医学，2007，15（3）：439-441.
[8]Elizabeth M，Hammond H，Barker P，et al. Standard reference material for HER2 testing：report of a National Institute of Standards and Technology-sponsored Consensus Workshop[J]. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology，2003，11（2）：103-106.
[9]Abdulghani J，Gu L，Dagvadorj A，et al. Stat3 promotes metastatic progression of prostate cancer[J].The American journal of pathology，2008，172（6）：1717-1728.
[10]王凤云，张倩倩，张艳桥，等. Stat3 在多种恶性肿瘤中的作用[J]. 国际免疫学杂志，2009（3）：222-226.
[11]张文，王雅杰，薛春燕，等. 乳腺癌组织磷酸化STAT3 表达及其与淋巴结转移关系的研究[J]. 中华肿瘤防治杂志，2008，15（6）：440-443.
[12]Horiguchi A，Oya M，Shimada T，et al. Activation of signal transducer and activator of transcription 3 in renal cell carcinoma：a study of incidence and its association with pathological features and clinical outcome[J].The Journal of urology，2002. 168（2）：762-765.。