毛细管电泳法分离9种磺胺类药物

毛细管电泳法分离9种磺胺类药物
陈建;杨灵芝;张金金;郭聪锐;冯颂磊;吴洲铭;赵凌国
【摘要】A new method was established by capillary electrophoresis for the separation of nine sulfonamides,including
sulfamethazine,sulfachloropyridazine,sulfapyridine,sulfacetamide,sulfathiaz ole,sulfamerazine,sulfaquinoxaline,sulfamethizol and sulfadimethoxine.The optimized conditions were that the running buffer was 20 mmol/L phosphates at pH 7.5,separation voltage was 8 kV,temperature was
20℃,detection wavelength was 210nm.The separation of nine sulfonamides could be completed in 20 minutes with satisfied accuracy.Good linearity was found within the range of 5-60μg/mL and the R ranged from 0.9922 to 0.9990.This method was used to determine the drug content in eye drops and powders and the results were consistent with the labeled amount.It is fast,simple,precise and feasible for the determination of sulfonamides.%本研究建立了毛细管电泳法分离磺胺二甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺吡啶、磺胺醋酰、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺甲噻二唑和磺胺间二甲氧嘧啶的方法,测定了滴眼液和兽药药粉中相关磺胺类药物
成分含量.毛细管为熔融石英毛细管(75/365μm,40/47 cm),运行缓冲液为20 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 7.5),电压8 kV,柱温为20℃,检测波长210 nm.9种
磺胺类药物分离效果良好.在5~60μg/mL浓度范围内,磺胺类药物峰高和浓度的线性关系良好,相关系数R为0.9922~0.9990.测定滴眼液中磺胺醋酰钠含量以及药粉中磺胺氯哒嗪钠的含量,与标示量基本相符.该方法具有快速、简便、准确度高等特点,适用于磺胺类药物含量的测定.
【期刊名称】《分析仪器》
【年(卷),期】2018(000)003
【总页数】6页(P51-56)
【关键词】毛细管电泳;磺胺类药物;含量测定
【作者】陈建;杨灵芝;张金金;郭聪锐;冯颂磊;吴洲铭;赵凌国
【作者单位】深圳市福田区疾病预防控制中心,深圳 518040;深圳大学药学院,深圳518060;深圳市福田区疾病预防控制中心,深圳 518040;深圳市福田区疾病预防控
制中心,深圳 518040;深圳大学药学院,深圳 518060;深圳大学药学院,深圳 518060;深圳市宝安区疾病预防控制中心,深圳 518100
【正文语种】中文
磺胺类(sulfonamides)药物在1932年被德国的杜马克首次应用[1]，是一类含有
对氨基苯磺酰胺结构药物的总称，主要通过与对氨基苯甲酸竞争性结合二氢叶酸合成酶，影响细菌核蛋白合成而发挥抑菌作用[2，3]，该类药物已有超过70 年的使用历史，具有抗菌谱广、价格低廉、性质稳定等优点，无论在临床还是兽药领域，该类药物均有着极其广泛的应用[4-6]。

目前磺胺类药物的检测方法有高效液相色
谱法(HPLC)[7-12]、免疫胶体金法[13]、ELISA 检测试剂盒法[14]、薄层色谱法[15]以及高效液相色谱质谱联用法[16]等。

在磺胺类药物的HPLC分离中，除了甲醇和乙腈等流动相，还需要添加乙酸等物质来改善拖尾[17-20]，较为繁琐，且HPLC自身的溶剂消耗量较大，污染大。

毛细管电泳(CE)兼有高压电泳及微柱液相分析的特点，其运行溶液多为水和无机盐，
样品消耗量在纳升级别，具有分析速度快、分离效率高(比HPLC高1～2数量级)、分离模式多，样品和试剂消耗少、污染小等特点，是一种低运行成本的高效分离方法。

文献报道的磺胺类药物CE分析方法中，部分需要特殊的检测器，如电导或化学发光检测装置[21-25]，或复杂的缓冲溶液体系[26，27]，分离对象多局限于3
种左右的磺胺类药物。

本实验建立了直接以磷酸盐缓冲液为运行溶液，同时测定多达9种磺胺类药物的方法，并用于滴眼液和兽药药粉中相应药物成分的含量测定，取得了良好效果。

1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪(Beckman Coulter instruments，Fullerton，CA，USA)，配备二极管阵列检测器、32Karat 7.0工作站；熔融石英毛细管(河北永年光纤厂)，内径75μm，外径365μm；磁力搅拌器(IKARCT基本型)；酸度计(型号S20)；蜗旋混匀器(型号MS3)；超声仪(Elmasonic S 100H，Germany)；氢氧化钠、盐酸、十水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠、硼砂、硼酸、柠檬酸钠和柠檬酸购自国药集团化学试剂有限公司；磺胺二甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺吡啶、磺胺醋酰、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺甲噻二唑、磺胺间二甲氧嘧啶对照品购自中国食品药品检定研究院；思芬牌磺胺醋酰钠滴眼液购自武汉五景药业有限公司(批号17080201)；博立达牌复方磺胺氯哒嗪钠粉购自江西博莱大药厂有限公司(批号20170609)。

1.2 缓冲液及样品制备
缓冲液配置方法如下: 分别配制pH 5.5、6.5、7.5和9.0的20mmol/L磷酸盐缓
冲液，20mmol/L硼砂-硼酸缓冲液和20mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

磺胺类药物标准品制备方法如下：分别取适量磺胺二甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺吡啶、磺胺醋酰、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺甲噻二唑、磺胺间二
甲氧嘧啶粉末，以50%甲醇溶液为溶剂配置成不同的浓度。

磺胺醋酰钠滴眼液样品制备方法如下：取滴眼液1.0mL，用50%甲醇溶液定容至1.0 L，摇匀。

然后取1.0mL，用50%甲醇溶液定容至10mL，过0.2μm滤膜，进样分析。

复方磺胺氯哒嗪钠粉样品制备方法如下：取样品约0.5 g，精密称定，置100mL 量瓶中，加水50mL，然后搅拌5min，超声5min，加甲醇50mL，摇匀；精密量取5mL，置500mL容量瓶中，用50%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀；过0.2μm 滤膜，进样分析。

1.3 毛细管电泳分析方法的建立
毛细管电泳分析条件如下：137.9 kPa压力下，用0.1 mol/L HCl、0.1 mol/L NaOH、水、电泳缓冲液冲洗毛细管各5分钟，预电泳平衡5分钟。

样品在3.45 kPa压力下进样3秒，然后电泳分离，柱温为20℃，检测波长210nm。

2 结果与分析
2.1 电解质种类对9种磺胺类药物分离效果的影响
考察电解质种类对分离效果的影响，结果如图1所示。

在20 mM磷酸盐缓冲溶液中，21min以内9种磺胺类药物基本分离，各峰峰型对称尖锐，柱效高，分离效果较好。

在20 mM硼砂缓冲溶液中，电渗流增强，分析时间缩短至12分钟，但各组分的分离度降低，大量组分无法分离，且峰高降低。

在20mM柠檬酸盐缓冲溶液中，不仅分析时间延长至30min，各峰的峰宽明显增加，分离效率下降，组分之间出现了峰合并。

综上所述，选择磷酸盐缓冲液作为优化的运行缓冲液。

为了确定各峰的归属，分别将各个磺胺药物进行电泳分析。

通过比对迁移时间、峰形与紫外可见吸收光谱(190nm～600nm范围)，得到磷酸盐电泳缓冲液中9种磺胺药物的归属，如图1所示。

2.2 缓冲液pH值对磺胺类药物分离效果的影响
缓冲液pH值影响着分析物的电泳淌度和电渗流大小，是电泳过程中重要的优化参数。

研究考察了在磷酸盐缓冲溶液中，pH 5.5～9.0的范围内，9种磺胺类药物的分离效果，结果如图2所示。

在偏酸性(pH5.5)或碱性(pH9.0)的条件下，磺胺类
药物的出峰数目减少，并出现峰合并现象。

在pH6.5 条件下，磺胺二甲嘧啶和磺
胺氯哒嗪无法分离。

在pH7.5条件下，9种磺胺类抗生素得到基本分离，分离效
果较好。

因此选择pH为7.5的磷酸盐缓冲溶液作为优化的电泳条件。

图1 电解质种类对标准品分离效果的影响各标准品浓度: 0.02 mg/mL; 电压: 8 kV; pH值: 7.5峰鉴定: 1.磺胺二甲嘧啶; 2.磺胺氯哒嗪; 3.磺胺吡啶; 4.磺胺醋酰; 5.磺胺噻唑; 6.磺胺甲基嘧啶; 7.磺胺喹恶啉; 8.磺胺甲噻二唑; 9.磺胺间二甲氧嘧啶.
图2 缓冲液pH值(磷酸盐缓冲溶液)对标准品分离效果的影响各标准品浓度: 0.02 mg/mL; 电压：8 kV峰鉴定: 1.磺胺二甲嘧啶; 2.磺胺氯哒嗪; 3.磺胺吡啶; 4.磺胺醋酰; 5.磺胺噻唑; 6.磺胺甲基嘧啶; 7.磺胺喹恶啉; 8.磺胺甲噻二唑; 9.磺胺间二甲氧嘧啶.
2.3 不同分离电压对磺胺类药物分离效果的影响
分离电压直接影响毛细管内电渗流和分析物电迁移速率的大小，从而影响分析时间和分离效率。

研究考察了在pH7.5的磷酸盐缓冲液中，分离电压5 kV～12 kV范围内，9种磺胺类药物分离效果。

结果如图3所示。

当分离电压为5 kV时，分析时间长达37mins，9种磺胺类药物峰型过宽，柱效较低。

当分离电压为8 kV时，分析时间几乎缩短一半，9种磺胺类抗生素峰形尖锐，分离情况最好。

当分离电压为12 kV时，虽然分析时间缩短至15min，但分离度下降明显。

因此，选择8 kV 作为优化的电压条件。

图3 分离电压对标准品分离效果的影响各标准品浓度: 0.02 mg/mL; pH值:7.5峰
鉴定: 1.磺胺二甲嘧啶; 2.磺胺氯哒嗪; 3.磺胺吡啶; 4.磺胺醋酰; 5.磺胺噻唑; 6.磺胺
甲基嘧啶; 7.磺胺喹恶啉; 8.磺胺甲噻二唑; 9.磺胺间二甲氧嘧啶.
2.4 方法学评价
对5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL和60 μg/mL的9种标准品进行电泳分析，以浓度(μg/mL,X)对峰高(Y)进行线性回归，9种物质线性关系良好。

以3倍信噪比(S/N)对应分析物浓度作为检出限，10倍信噪比对应分析物浓度作为定量限，9种磺胺药物的相关数据如表1所示。

表1 9种磺胺类药物线性回归数据、检出限和定量限样品回归方程相关系数检出限(μg/mL)定量限(μg/mL)磺胺二甲嘧啶Y=0.0048x-0.08170.99900.0690.229磺
胺氯哒嗪Y=0.0064x+0.02370.99500.0520.172磺胺吡啶
Y=0.0062x+0.01820.99790.0530.177磺胺醋酰
Y=0.0025x+0.02290.99620.1320.440磺胺噻唑Y
=0.003x+0.03470.99280.1100.367磺胺甲基嘧啶Y =0.0028x-
0.00110.99540.1180.393磺胺喹恶啉Y =0.0023x+0.02560.99220.1430.478磺胺甲噻二唑Y =0.0021x+0.01530.99490.1570.524磺胺间二甲氧嘧啶Y
=0.0027x+0.02970.99800.1220.407
2.5 样品测定
为了考察方法在药物含量检测中的应用，测定了兽药药粉中磺胺氯哒嗪钠以及滴眼液中磺胺醋酰钠的含量。

博立达牌复方磺胺氯哒嗪钠粉购自江西博莱大药厂有限公司(批号20170609)，包装标识规格：1000 g药粉含磺胺氯哒嗪钠625 g和甲氧
苄啶125 g。

药粉经简单溶解和稀释后，可以直接进样分析，其样品电泳图如图
4(a)所示，该药粉的辅料及其他成分不影响检测，杂峰与目标峰完全分离，用本方法测得药粉中磺胺氯哒嗪钠的含量为0.619 g/g，与标示量(0.625 g/g)基本相符。

思芬牌磺胺醋酰钠滴眼液购自武汉五景药业有限公司(批号17080201)，滴眼液稀释后进样，只有目标峰出现，无任何干扰峰，用本方法测得滴眼液中磺胺醋酰钠含
量为0.142 g/mL，与标示量(0.15g/mL)基本相符。

图4 复方磺胺氯哒嗪钠粉样品电泳图(a).复方磺胺氯哒嗪钠粉样品；(b).磺胺醋酰
钠滴眼液样品；(c).9种磺胺药物混合标准品标准品浓度：0.02 mg/mL峰鉴定: 1.磺胺二甲嘧啶; 2.磺胺氯哒嗪; 3.磺胺吡啶; 4.磺胺醋酰; 5.磺胺噻唑; 6.磺胺甲基嘧啶;
7.磺胺喹恶啉; 8.磺胺甲噻二唑; 9.磺胺间二甲氧嘧啶.
3 讨论与小结
使用毛细管电泳和DAD检测器，建立了同时检测9种磺胺类药物的方法。

在优化的电泳条件下，9种磺胺类药物成分基本分离，具有良好的线性关系。

使用该方法测定了眼药水和兽药药粉中磺胺类药物含量，与标示含量一致。

本方法简单、快速、准确，适用于磺胺类药物成分的快速检测。

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