白酒酒醅发酵过程中酶活与酯类生成的相关性分析与主成分分析

白酒酒醅发酵过程中酶活与酯类生成的相关性分析与主成分分
析
郭建华;郭宏文;邹东恢;刘晓兰;贾士儒
【摘要】以白酒酒醅为研究对象,在酒醅发酵过程中,测定了酒醅中的淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶和脂肪酶的活性,同时,测定了酒醅中总酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯和乳酸乙酯的含量.利用相关分析和主成分分析研究了平均酶活与酯类生成量之间的相关性.相关分析表明,不同酶活与酯类生成之间存在不同程度的相关性.通过主成分分析,提取了6种酶的2个主成分,代表了酶的2种作用.根据主成分与酯类生成的相关性,探讨了酶活对酯类生成的影响.
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2013(039)011
【总页数】6页(P44-49)
【关键词】酒醅;酶活;酯类;相关性分析;主成分分析
【作者】郭建华;郭宏文;邹东恢;刘晓兰;贾士儒
【作者单位】齐齐哈尔大学食品与生物工程学院,黑龙江齐齐哈尔,161006;天津科技大学生物工学院,天津,300222;齐齐哈尔大学食品与生物工程学院,黑龙江齐齐哈尔,161006;齐齐哈尔大学食品与生物工程学院,黑龙江齐齐哈尔,161006;齐齐哈尔大学食品与生物工程学院,黑龙江齐齐哈尔,161006;天津科技大学生物工学院,天津,300222
【正文语种】中文
酯类是中国白酒中的主要风味物质，其含量约占白酒风味物质总量的75% ～95%［1］。

白酒中的酯类有100多种，其中乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯和乳酸乙酯是主要的酯类，其含量约占总酯含量的90%左右［2］。

酒中的风味物质是决定白酒香气，口感和风格的关键［3］。

有些酯类使白酒具有水果的香气，如己酸乙酯使白酒具有一种复合水果香气［4］。

除了原料含有酯类外，大量的酯类物质是在酒醅发酵过程中由微生物代谢产生的［5］。

酒醅中的微生物来源于酒曲、酿造水、空气及窖池，包括霉菌、放线菌、酵母和细菌。

在酒醅发酵过程中，微生物产生大量的酶，催化酒醅中的各种生化反应。

白酒发酵是一个开放体系，由于自然环境的差别，不同地方的酒醅中微生物菌群有所差异，其发酵性能也有很大差别［6］，使得不同产地的白酒中风味物质的含量及种类不同。

在发酵过程中，酒醅中的微生物分泌的各种酶，将原料中蛋白质、糖类、脂肪等大分子降解为氨基酸、寡糖、脂肪酸等小分子有机物质。

这些小分子物质，一方面供微生物代谢利用，另一方面为香味物质的产生提供丰富的前体物质。

酶的活性不仅影响酒醅中各种物质的转化，也直接影响到香味物质的种类和数量，从而对香味物质的形成产生深刻的影响［7］。

如酯酶能直接催化丙酸及乙酸与乙醇酯化，生成丙酸乙酯及乙酸乙酯［8］。

淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶等能将原料中的大分子物质降解，为细胞生长及代谢提供营养物质，同时为酯类物质的合成提供前体，因此这些酶与酯类物质的形成也具有一定的相关性。

如吴华昌研究了脂肪酶对白酒的总酯的影响［9］，发现脂肪酶Novozym435可以明显提高白酒
中总酯的含量。

在酒醅中添加纤维素酶，可以提高酒中酯类特别是乙酸乙酯的含量，降低醛类和杂醇油的含量［10－11］。

在研究因素与结果之间的相关性时，可以利用相关分析计算出各个因素与结果之间的相关系数，通过相关系数的大小可以判断因素与结果之间相关度的大小以及因素
对结果影响作用的强弱。

但是在很多情况下，由于各个因素之间存在彼此影响，造成因素与因素之间具有重叠信息，从而造成直接相关系数的虚假性。

为了消除这种虚假性，通过主成分分析，提取出多因素的主成分，根据原始变量在主成分方向上的载荷，考察原始变量在主成分上与结果之间的相关系数［12］。

由于排除了不
相关的因素，主成分分析更清晰地反映出因素与结果之间的关系，从而考察出各个因素对结果影响作用的大小［13］。

据此，本实验通过检测酒醅发酵过程中的多
种酶活及酯类物质的生成，利用相关分析和主成分分析，考察酶活与酯类物质生成之间的关系，确定酒醅发酵过程不同的酶对酯类物质生成的影响。

1 材料与方法
1.1 仪器与材料
生化培养箱SPX-150II，天津泰斯特仪器有限公司;TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司;气相色谱仪GC-2010，日本岛津公司。

高温大曲及入窖酒醅:从某白酒厂取得。

1.2 实验方法
1.2.1 白酒酒醅的制作
取高粱和小麦各800 g，粉碎成粗粒后混合均匀装入大烧杯内，然后加入1 L 80℃的水，搅拌均匀。

放入保温箱内18 h。

然后加入稻壳300 g，搅拌均匀，放入蒸
锅内蒸煮80 min。

取出等温度降低到20℃时，加入大曲粉200 g，入窖酒醅200 g，混合均匀。

用保鲜膜封住烧杯口，放入生化培养箱中进行厌氧发酵，温度设定为30℃。

1.2.2 酶活的测定
在酒醅发酵过程中，从第4天开始，每天取发酵酒醅20 g，装入三角瓶中，加入80 mL水，于振荡器上振荡30 min后用滤纸过滤，取滤液测定酶活，然后换算为固态酒醅的酶活。

淀粉酶活性测定参见参考文献［14］，酶活定义为在实验条件下1 mL酶液每分
钟使淀粉碘液吸光度下降10%为1个酶活单位。

糖化酶活性测定采用DNS法［15］，酶活定义为在实验条件下1 mL酶液每分钟催化底物生成1mol还原糖为1个酶活单位。

蛋白酶活性测定采用福林酚法［15］，酶活定义为在实验条件下1 mL酶液每分钟水解1g酪素产生酪氨酸为1个酶活单位。

纤维素酶(FPase activity)活性测定根据参考文献［16］，酶活定义为在实验条件下1 mL酶液每分钟水解底物产生1μmol还原糖为1个酶活单位。

果胶酶活性测定根据参考文献［17］，酶活定义为1 mL酶液在实验条件下每小时分解果胶产生1 mg半乳糖醛酸为1个酶活单位。

脂肪酶活性测定参考文献［18］，酶活定义为1 mL酶液每
分钟水解乙酸对硝基苯酚酯生成1 μmol对硝基苯酚为1个酶活单位。

1.2.3 酯类物质含量的测定
从发酵的第4天开始，每天取发酵酒醅20 g，装入蒸馏瓶中，加入100 mL纯净
水进行蒸馏，当得到80 mL蒸馏液时结束蒸馏，用此蒸馏液进行酯类物质的测定，然后换算为固态酒醅中的酯含量。

总酯的测定方法采用酸滴定法［19］。

吸取蒸馏液20 mL于250 mL回流瓶中，加2滴酚酞指示剂，以NaOH标准滴定液滴定至微粉红色，记录消耗的NaOH标准滴定溶液的体积(mL)。

再准确加入NaOH标准滴定溶液20.00 mL，摇匀，放
入几颗沸石或玻璃珠，装上冷凝管，于沸水浴上回流30 min，取下，冷却。

然后用H2SO4标准滴定溶液进行滴定，使微红色刚好完全消失为终点。

记录消耗
H2SO4标准滴定溶液的体积Vb，同时吸取乙醇无酯溶液20 mL，按上述方法同
样操作做空白实验验，记录消耗H2SO4标准滴定溶液的体积Va。

结果计算:
式中:X，样品中总酯的质量浓度(以乙酸乙酯计)，mg/mL;c，H2SO4标准滴定溶
液的实际浓度，mol/L;
Va，空白实验验样品消耗H2SO4标准滴定溶液的体积，mL;Vb，样品消耗
H2SO4标准滴定溶液的体积，mL;88，乙酸乙酯的摩尔质量的数值，g/mol。

乙酸乙酯，丁酸乙酯，己酸乙酯和乳酸乙酯的测定采用气相色谱法［20］。

色谱条件:DB-WAX(聚乙二醇键合交联固定相)，熔融石英毛细管色谱柱20 m×0.1 mm×0.1 μm。

进样口温度230℃，进样体积0.8 μL，分流比1∶180;载气为高纯氮气，采用恒压方式(400 kPa)控制;柱温采用程序升温:初温36℃，保持2.5 min 后以20℃/min的速率升温至70℃，再以30℃/min的速率升温至180℃，最后以50℃/min的速率升到220℃并保持3 min(总时间:12 min);检测器温度260℃;氢气流量为30 mL/min，空气流量为 300 mL/min，尾吹气流量为30 mL/min。

1.2.4 相关分析及主成分分析
相关分析及主成分分析利用软件SPSS 16.0 for Windows实现［21－22］。

2 结果与讨论
从表1数据可以看出，淀粉酶活力从第5天开始，一直平稳下降。

蛋白酶活力在发酵前期(4～7 d)不断升高，之后开始下降。

其他酶活在发酵前期有所下降后，又开始上升，直到发酵中期，酶活会开始下降。

由于酒醅中的微生物菌群种类及数量在发酵过程中不断变化［23］，致使产生酶的种类及数量随之变化。

同时由于乙醇的浓度在酒醅中不断升高，对酶起到一定的抑制作用，从而使各种酶活在发酵后期下降很多。

酯类物质含量在发酵过程中不断升高。

除了一部分由酒曲、入窖酒醅及原料带入外，增加的部分主要由酒醅中的微生物合成。

根据表1中数据可以看出，各种酯类在发酵前期及后期增加量较少，在发酵中期增加量最大。

这与各种酶的活力变化有关，说明酶活与酯类的生成具有一定相关性。

为了计算酶活与酯类物质生成之间的相关性，用相邻2 d的平均酶活与相邻2 d酯类物质含量的差值(增加量)一一对应，计算平均酶活与酯类物质增加量的相关系数，结果如表2所示。

表1 发酵过程中酒醅中酶活及酯类物质含量Table 1 Enzymes activity and
esters content in liquor fermented grains during fermantation发酵天数/d 酶活/(U·g－1)酯类/(mg·g－1)0.028 0.347 5 16.4 20.3 25.7 16.4 14.2 9.2 0.69 0.147 0.016 0.031 0.368 6 15.8 19.7 30.5 16.8 10.1 9.8 0.79 0.162 0.020
0.034 0.405 7 14.7 20.4 35.3 20.7 9.1 11.2 0.88 0.187 0.025 0.052 0.464 8 12.9 23.9 29.4 21.4 11.2 14.5 0.99 0.215 0.031 0.061 0.502 9 12.6 26.7 27.2 20.3 10.6 16.7 1.11 0.253 0.037 0.067 0.568 10 12.7 25.3 26.5 20.8 13.8 15.4 1.24 0.298 0.043 0.072 0.624 11 12.1 24.4 22.6 15.6 10.7 14.8 1.35 0.342 0.048 0.077 0.681 12 10.5 19.8 20.7 13.4 8.4 12.1 1.46 0.379 0.042 0.083 0.739 13 10.1 16.4 16.4 11.7 4.1 11.7 1.56 0.411 0.047 0.089 0.781 14 8.3 14.5 10.1 8.6 2.1 10.2 1.64 0.450 0.052 0.097 0.823 15 6.9 13.2 8.7 7.3 1.5 9.4 1.71 0.475 0.057 0.102 0.852 16 6.4 10.4 5.2 4.5 1.3 8.7 1.77 0.499 0.061 0.10乳酸乙酯4 16.2 22.7 23.9 19.4 15.8 10.4 0.61 0.136 0.014淀粉酶糖化酶蛋白酶纤维素酶果胶酶脂肪酶总酯乙酸乙酯丁酸乙酯己酸乙酯e 6 0.884
表2 酶活之间及酶活与酯类物质生成之间的相关系数Table 2 Thecorrelation coefficients between enzymes and between enzymes and esters production注:*表示在0.05水平上具有显著性;＊＊表示在0.01水平上具有显著性。

酶活酯类总酯乙酸乙酯丁酸乙酯己酸乙酯乳酸乙酯淀粉酶 1 0.669* 0.893＊＊ 0.827 0.901＊＊淀粉酶糖化酶蛋白酶纤维素酶果胶酶脂肪酶0.107 0.383－0.322－0.130－0.001 0.142糖化酶 1 0.808＊＊ 0.924＊＊ 0.872＊＊ 0.803＊＊ 0.855＊＊ 0.399 0.164 0.009 0.626*蛋白酶 1 0.953＊＊ 0.839＊＊ 0.402 0.662* 0.003 0.189 0.286 0.458纤维素酶 1 0.883＊＊ 0.601* 0.749＊＊ 0.164
0.251 0.214 0.499果胶酶 1 0.428 0.571－0.056－0.153－0.198 0.280脂肪酶
1 0.876＊＊ 0.821＊＊ 0.419 0.11
2 0.748＊＊总酯 1 0.628 0.418 0.156 0.761＊＊乙酸乙酯 1 0.482 0.295 0.742＊＊丁酸乙酯 1 0.62
3 0.371己酸乙酯 1
0.306乳酸乙酯1
根据表2可以看出，酯的生成与多种酶具有很显著的相关性，如总酯的生成与糖
化酶，蛋白酶，纤维素酶和脂肪酶具有显著的相关性;乙酸乙酯的生成与脂肪酶具
有显著的相关性;乳酸乙酯的生成与糖化酶和脂肪酶具有显著的相关性。

这种直接
相关系数在一定程度上反映了酯类物质的生成与酶活之间的相关程度，但是由于各种酶活之间也存在相关性，即彼此存在着一定程度的互相影响，从而会造成信息重叠，影响到酯类物质的生成与酶活之间相关系数的真实性。

为了消除偶然因素以及各种指标之间的相互作用，对6种酶活力指标进行主成分分析，通过研究主成分
与酯类物质生成之间的关系，来探讨酶活与酯类物质生成之间的相关性。

以6种酶活为原始变量，将其相邻2 d的平均酶活值输入到SPSS软件中，利用因子分析，经坐标转变后得到6个互不相关的主成分F1～F6及其特征值。

每个主成分皆反映了一定的原始变量的信息，特征值代表主成分反映原始变量信息的数量，其总和为原始变量的个数，即为6。

主成分的特征值越大，表示该主成分反映的原始变量的信息越多。

如表3所示，根据特征值大于1，提取了2个主成分F1和F2，其特征值之和为5.785，积累贡献率达到了96.409%，基本上完全反映了6种酶
的全部信息，因此可以用主成分 F1和F2代表全部原始酶活进行讨论。

表3 酶的主成分及其特征值Table 3 The principal components of enzymes and eigenvalues主成分/%F1初始特征值特征值贡献率/% 积累贡献率/%主成分的特征值及贡献率特征值贡献率/% 积累贡献率4.730 78.831 78.831 4.730
78.831 78.831 F2 1.055 17.578 96.409 1.055 17.578 96.409 F3 0.190 3.161 99.570 F4 0.015 0.254 99.825 F5 0.008 0.135 99.960 F60.002 0.040 100.000 表4中数据表示各个酶活在主成分上的载荷。

通过载荷可以看出，第一主成分F1
主要代表了淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶和果胶酶的作用。

这一主成分的主要作用是降解酒醅原料中的大分子物质，为微生物细胞生长及代谢提供必要的营养
物质，虽然脂肪酶降解脂肪也为微生物提供一定的营养物质，但是作用较小，因此在第一主成分中的载荷最小。

第二主成分F2主要体现了为酯类生成提供前体物质的作用，如脂肪酶降解脂肪生成脂肪酸，是细胞合成酯类物质必须的原料，因此在主成分F2中，脂肪酶的载荷最大，达到0.801。

表4 主成分的载荷矩阵Table 4 Principal components matrix主成分F1 F2
0.858－0.507糖化酶 0.949 0.296蛋白酶 0.939－0.201纤维素酶 0.984 0.018
果胶酶 0.942－0.162脂肪酶淀粉酶0.597 0.801
用表4中的数据除以各个主成分相对应特征值的平方根便得到主成分中每个变量
所对应的系数。

将表1中相邻2天的平均酶活的标准化数据带入主成分表达式中，即可得到主成分的值，如表5所示。

表5 主成分的值Table 5 The value of principal componentsF1 F2 1.380 012
－1.523 31 0.957 464－1.658 34 1.092 712－1.381 96 1.644 812－0.149 66 1.962 651 1.120 118 2.091 743 1.304 134 1.532 797 1.022 659 0.226 821
0.664 29－1.091 04 0.273 218－2.362 69 0.209 994－3.349 7 0.133 196－
4.085 58－0.014 35
作为新的变量指标F1和F2是互不相关的综合变量，可以通过研究这2个变量与
酯类生成之间的相关性来研究探讨酶活与之类生成之间的相关性。

利用相关分析计算主成分与酯类生成之间的相关系数，结果如表6所示。

表6 主成分与酯类生成的相关系数Table 6 Thecorrelation coefficients between principal components and esters production注:*表示在0.05水平
上具有显著性;＊＊表示在0.01水平上具有显著性。

总酯乙酸乙酯丁酸乙酯己酸乙酯乳酸乙酯F1 1 0 0.753＊＊F1 F2 0.419 0.068 0.554 0.149 0.121 0.078
0.496 F2 0 1 0.520 0.901＊＊
从表6可以看出，主成分F1和F2之间不具有相关性，说明这2个因素之间不存
在互相影响。

总酯的生成与主成分F1具有显著的相关性，而与主成分F2的相关
性不显著，说明酯类物质总的生成量主要与细胞营养物质的提供有紧密关系，而与前体物质的生成不具有明显的关系。

乙酸乙酯的生成与主成分F2的相关性最显著，而与F1的相关系数只有0.149，不具有统计学意义，可以认为不具有相关性，因
此乙酸乙酯的生成与细胞的营养无关，主要是与前体物质，即脂肪酸的生成关系紧密。

同时，F2主要体现了脂肪酶的作用，因此乙酸乙酯的生成与脂肪酶的显著性
最大。

丁酸乙酯的生成与乙酸乙酯类似，只是相关性不显著。

而己酸乙酯的生成与2个主成分都没有相关性，其原因是影响己酸乙酯生成的因素比较复杂，除了受酶的影响之外，还与其他因素有紧密关系。

从相关系数上看，乳酸乙酯的生成与2
个主成分具有相似的相关性，说明乳酸乙酯的生成受到2个方面同样的影响。

而且，前体物质乳酸的生成量不仅与脂肪酶的作用有关，同时与微生物代谢有紧密关系。

因此，乳酸乙酯的生成与2个主成分具有相似的相关系数，但都不显著。

根据原始数据和主成分分析还可以看出，淀粉酶和蛋白酶一方面通过主成分F1对酯类物质的生成起到正向作用，另一方面通过主成分F2的作用对酯类物质的生成起负向作用。

当淀粉酶和蛋白酶活力比较低时，正向作用占主体，表现为酶活增加，酯类物质生成量增加。

而当淀粉酶和蛋白酶活力比较高时，负向作用占主体，表现为酶活增加，酯类物质生成量减少。

从原始数据上可以看出，当淀粉酶和蛋白酶活力最低和最高时，酯类物质的增加量都是很低的。

因此，酶活对酯类生成的影响是复杂的，酶活力的大小范围不同，其对酯类物质生成的影响是变化的，这也说明了白酒发酵过程中风味物质代谢的复杂性。

3 结论
白酒酒醅发酵过程中，酯类物质的生成与各种酶之间存在不同的相关性。

根据相关性分析，总酯的生成与糖化酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶具有显著的相关性;乙
酸乙酯的生成与脂肪酶具有显著的相关性;乳酸乙酯的生成与糖化酶和脂肪酶具有
显著的相关性。

根据主成分分析，将各种酶的作用分为两大类，一类是降解酒醅原料中的大分子物质，为微生物细胞生长及代谢提供必要的营养物质，一类是降解原料中的脂肪为酯类生成提供前体物质。

不同酯的生成与两类酶的作用的性关性不同。

同时，酶活力大小范围不同时，对酯类物质生成的影响是变化的。

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