RP-HPLC法测定新疆不同产地药桑叶中芦丁、异槲皮苷的含量

RP-HPLC法测定新疆不同产地药桑叶中芦丁、异槲皮苷的含
量
阿合买提江·吐尔逊;赵文惠;孙莲;王岩;张煊;古丽江·马合苏提汗
【摘要】目的考察新疆不同产地、不同采摘时间药桑叶中芦丁、异槲皮苷的含量变化.方法采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC),以大连依利特 Hypersil ODS(150 mm×4.6 mm,5 μm)为色谱柱,进样量20 μl,流动相为乙腈(A)-水(B)-0.2%磷酸溶液(pH=4.8)(C),梯度洗脱[0 min,A-C(18:82);4 min,A-C(21:79);10 min,A-C(8:92)],流速1.0 ml/min,检测波长为358 nm,柱温为25℃.结果不同产地、不同采摘时间的药桑叶中芦丁和异槲皮苷的含量均有一定的差异,喀什地区、5～6月份二者含量较高.结论药桑叶中芦丁和异槲皮苷的含量与产地和采摘季节等有关,尤其以季节的影响大.
【期刊名称】《新疆医科大学学报》
【年(卷),期】2010(033)010
【总页数】4页(P1194-1197)
【关键词】药桑叶;芦丁;异槲皮苷;反相高相液相色谱法
【作者】阿合买提江·吐尔逊;赵文惠;孙莲;王岩;张煊;古丽江·马合苏提汗
【作者单位】新疆医科大学药学院分析/药分教研室,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学药学院分析测试中心,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学药学院化学教研室,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学药学院分析/药分教研室,新疆,乌鲁木
齐,830011;新疆医科大学药学院分析/药分教研室,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学药学院药学2006-2班,新疆,乌鲁木齐,830011
【正文语种】中文
【中图分类】R917
桑叶为桑科(Moraceae)桑属(Morus L.)植物的叶，中国大部分地区均有栽培生产。

桑叶入药首见于《神农本草经》，列为中品。

用于风热感冒、肺热燥咳、头晕头痛、目赤昏花,收载于2005版《中国药典》(一部)[1]。

现代药理研究表明，桑叶具有
增强免疫、促进造血细胞生长、降糖降脂[2-3]、抗氧化[4]、抗肿瘤[5]、抗诱变等多种活性。

近年来对桑叶化学成分的研究表明，桑叶中含有黄酮类、生物碱类、苯丙素类、有机酸类、甾体及三萜类等多种化合物[6]。

黄酮类化合物是桑叶的重要
活性成分之一[7-8]。

新疆药桑是维吾尔族重要的民间药材，维吾尔语称沙土提，
药桑椹1988年被国家卫生部列为首批药食同植物，被医学界誉为“民间圣果”和“世纪的最佳保健果”[9]。

按新疆习惯命名法，新疆桑树分为黑桑、白桑、粉桑、公桑和药桑5大类型[10]，其中新疆药桑在桑树植物分类学上属于半载培半野生的的黑桑种，体细胞染色体倍数性为自然22倍体(2n=22x=308)，是自然界极为罕
见的稀贵桑树半栽培半野生资源，也是我国唯一的黑桑种，栽培适应地只限于新疆，主要分布在新疆阿克苏地区、巴音郭楞蒙古自治州和克孜勒苏柯尔克孜自治州[11]。

新疆药桑是营养价值很高的天然绿色食品。

目前生产上开发最多的为药桑桑叶茶。

药桑中的黄酮类物质主要成分包括芦丁、异槲皮苷、槲皮苷、黄芪苷等，其中以芦丁和异槲皮苷含量最高。

这些黄酮类物质具有降血压、抗衰老、防癌、抑制血清脂质增加和抑制动脉粥样硬化形成的作用，并能改善肝功能，软化毛细血管，改善血液循环系统，有效防止脑中风、脑血栓、脑溢血等心脑血管疾病，还有抗炎、抗过
敏、利尿、解痉、镇咳、降血脂、强心等作用以及祛风清热、凉血明目、利尿等生理作用[12]。

现行药典采用HPLC法测定桑叶中芦丁含量，孟磊等[13]报道对新疆桑叶总黄酮含量进行测定，但对新疆药桑中芦丁和异槲皮苷的测定尚未见报道。

本文建立了同时测定新疆药桑叶中芦丁、异槲皮苷含量的RP-HPLC方法，并考察新疆不同产地、不同采摘时间药桑叶中芦丁、异槲皮苷的含量变化，以便为新疆药桑叶的质量控制和合理开发提供参考。

1 仪器与试剂
Waters高效液相色谱仪2690-2487，乙腈、甲醇(色谱醇、分析纯)；0.2%磷酸溶液；芦丁(中国药品生物制定检定所)和异槲皮苷(天津一方科技有限公司)的标准品，其余试剂为分析纯。

2 方法
2.1 色谱条件色谱柱：大连依利特 Hypersil ODS(4.6 mm×150 mm，5 μm)，
流速为1.0 ml/min，检测波长为358 nm，柱温25℃；进样量20 μl，流动相A：乙腈；B：水；C：0.2%磷酸溶液(pH = 4.8)；梯度洗脱程序：0 min， A-C (18∶82)；4 min，A-C (21∶79)；10 min，A-C (8∶92)，结果见图1。

图1 混合对照品(A)及桑叶样品(B)色谱图(1：芦丁; 2：异槲皮苷)
2.2 标准品溶液的制备精密称量芦丁1.7 mg、异槲皮苷1.2 mg，置入10 ml容
量瓶，加色谱醇甲醇溶解并稀释至刻度，得到混合对照品溶液浓度(芦丁170
μg/ml、异槲皮苷120 μg/ml)。

2.3 供试品溶液的制备干燥桑叶，过40目筛，称取1 g，用分析醇甲醇为溶剂，
固液比为1∶30，进行加热回流提取，提取2 h过滤，残渣再加入30 ml甲醇提
取2 h，过滤，合并滤液定容置50 ml量瓶中，得供试品溶液。

2.4 标准曲线绘制芦丁、异槲皮苷对照品适量，用色谱纯甲醇配成含芦丁170
μg/ml 、异槲皮苷120 μg/ml的混合溶液，精密量取混合对照品溶液0.15、0.25、0.50、1.00、2.00、2.50、3.25 ml，分别置于5 ml容量瓶中，加色谱纯甲醇至
刻度，摇匀，即得不同浓度的混合对照品溶液。

分别进样20 μl，以峰面积(Y)为纵坐标，对照品溶液的浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，求得芦丁和异槲皮苷的回
归方程分别为：芦丁： Y=24 925X-30 950, r=0.999 9; 异槲皮苷: Y= 35 517X-36 804, r=0.999 9。

结果表明，芦丁和异槲皮苷2种黄酮成分的浓度分别在
5.1～110.5 μg/ml、3.6～78.0 μg/ml范围内呈良好的线性关系。

2.5 稳定性试验取同一样品溶液，分别于0、1、2、4、8、24 h进样，测峰面积，计算得芦丁和异槲皮苷RSD值分别为1.9%、2.0%，说明样品溶液在24 h内基本稳定。

2.6 精密度试验取对照品2 ml置10 ml容量瓶中，定容。

连续进样5次，测得峰面积，计算芦丁、异槲皮苷峰面积的RSD分别为1.8%、1.5%,说明该仪器精密度良好,结果见表1。

2.7 重复性实验取新疆药桑叶粉末(40目)制备供试品溶液，平行操作5次，测得
芦丁和异槲皮苷含量的RSD值分别为1.5%、1.3%，表明该方法重复性良好。

表1 精密度试验结果序号芦丁峰面积(AU)异槲皮苷峰面积(AU)RSD值(%)13 473 6514 511 82723 529 6664 666 2261.833 531 7234 669 5631.543 540 2064 664 92153 538 2034 670 245
2.8 加样回收率试验加样回收率试验精密称取已测知含量的药桑叶样品(喀什地区
莎车县2009年6月)3份，每份精密量取5 ml置10 ml量瓶中，每份分别精密加人混合对照品溶液(芦丁浓度:1.9 mg/ml ，异槲皮苷浓度:0.9 mg/ml)1、1.5、2 ml，用流动相(乙腈∶0.2%磷酸溶液=20∶80)定容至刻度，测得低、中、高3个
浓度的平均回收率(n=3)，每种浓度连续进样3次，芦丁的平均回收率分别为103.7%、103.7%、99.3%；RSD为0.2%、0.5%、0.2%，总平均回收率为
102.2%，平均RSD值为0.3%；异槲皮苷分别为98.9%、95.7%、97.6%； RSD 为0.2%、0.3%、0.06%，总平均回收率为97.4%，平均RSD值为0.19%，结果见表2。

表2 回收率测定结果(n=3)序号样品量(μg/ml)芦丁异槲皮苷加入量(μg/ml)芦丁异槲皮苷测得量(μg/ml)芦丁异槲皮苷回收率(%)芦丁异槲皮苷平均回收率(%)芦丁异槲皮苷RSD(%)芦丁异槲皮苷52.9627.96高浓度组
13.4310.1238.018.052.8527.00103.798.952.7327.8543.1523.09中浓度组13.4310.1228.513.542.7722.96103.795.7102.297.40.30.1943.1023.0735.2218 .89低浓度组13.4310.1219.09.032.3718.9199.397.632.2618.91
3 样品测定
将不同产地、不同采摘时间的药桑叶样品按制备2.3样品溶液，按2.1项的色谱条件进样，测得峰面积，计算芦丁和异槲皮苷的含量。

3.1 不同产地的药桑叶中芦丁和异槲皮苷的含量喀什地区药桑中芦丁和异槲皮苷的含量较大(表3)。

表3 不同产地药桑中芦丁、异槲皮苷的含量产地名称采集时间芦丁含量(%)异槲皮苷含量(%)阿克苏2009年9月0.120.06喀什2009年5月0.160.09库尔勒2009年10月0.030.03
3.2 不同采摘时间药桑叶中芦丁和异槲皮苷的含量不同采摘时间桑叶中的芦丁和异槲皮苷含量均有差异,5月份和6月份桑叶中的芦丁和异槲皮苷含量高,7、8月份含量降低,这可能是由于5、6月份药桑叶为新鲜嫩叶,所以含量高于7、8月份(表4)。

表4 不同采摘季节桑叶中芦丁和异槲皮苷的含量样品采集时间芦丁含量(%)异槲皮苷含量(%)2009年5月0.160.09喀什药桑2009年6月0.130.092009年7月0.030.032009年8月0.030.04
4 讨论
4.1 样品溶液制备方法的考察本实验在参考文献的同时考察了不同浓度乙醇(50%、70%、80% )、甲醇为提取溶剂，不同浓度乙醇和甲醇的提取结果基本一致，但不同浓度的乙醇提取的样品杂质峰也较多，因此选用甲醇为溶剂。

提取方法考察了热回流、超声提取，发现回流提取效率高。

比较回流提取不同提取次数及每次提取时间 (2 h 2次、2 h 3次、4 h 1次)，再比较提取溶剂用量(30 ml、50 ml)，提取率基本一致，因此选择30 ml，甲醇回流提取 2 h 2次。

4.2 检测波长的选择采用紫外检测器，对标准品进行最大波长扫描，结果显示芦
丁和异槲皮苷在256、358 nm处有最大吸收波长，经过高效液相进样，发现在256 nm杂质峰很多，同时也参考了大量的文献，选择358 nm为测定波长。

4.3 流动相的选择本实验通过大量阅读文献，对以下2种流动相方法做了考察：
甲醇∶水和乙腈∶0.2%磷酸缓冲盐，2种分别作了梯度和等度条件的考察，结果表明，使用甲醇时芦丁和异槲皮苷对照品未能完全分离，使用水和乙腈时虽然芦丁和异槲皮苷对照品达到基线分离，但峰形不好，加入0.2%磷酸缓冲盐后峰形得到改善，改用乙腈∶0.2%磷酸缓冲盐作为流动相梯度洗脱，由图1可看出，对照品以
及样品各组分均能较好分离。

因此选择了乙腈∶0.2%磷酸缓冲盐作为流动相梯度
洗脱。

4.4 未知物分析从样品图(图1B)可知，除已知的芦丁和异槲皮苷外，至少还有1
种含量较高的物质(保留时间为4、4.5 min)，有待进一步研究确定。

芦丁和异槲皮苷是药桑叶中主要的黄酮类成分，可以作为药桑叶黄酮测定的指标。

本实验采用RP-HPLC法，采用梯度洗脱方式，在10 min内同时测定了不同产地、不同季节药桑叶中芦丁和异槲皮苷的含量，结果表明不同产地药桑叶中芦丁、异槲皮苷的含量有一定的差异，可能是因为地理环境的不同，天气、温度变化的不同导致这些差异。

不同季节的药桑叶中二者的含量也有明显的差异，说明采摘时间越早
桑叶中芦丁、异槲皮苷的含量越高，并且随着季节的变化含量有明显的降低。

药桑叶中芦丁、异槲皮苷的含量有助于进一步研究其效应成分及质量的有效控制。

由于药桑叶中芦丁、异槲皮苷的含量受不同产地、不同季节等多种因素的影响，作用因素较为复杂，有待进一步的考察。

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