提取植物组织RNA的准备工作和操作规范

提取RNA前的准备工作
1、提取RNA操作全程及配制RNA提取试剂必须穿实验服，戴口罩和一次性手套，触摸皮
肤（例如面部）、门把手及实验室其他未处理过RNase的普通物体表面后立即更换手套。

2、器具干烤：需要干烤的器具包括金属和玻璃制品，如研钵、钥匙、镊子、剪刀、试剂瓶
（200mL、500mL、1L）、量筒（50mL、100mL）、烧杯，即所有在配制RNA提取试剂过程中需要用到的玻璃器皿均需要干烤处理。

所有干烤的器具均用锡箔纸包住，如研钵、钥匙、镊子、剪刀和匀浆器，容器用锡箔纸封口，如试剂瓶、量筒和烧杯。

180℃干烤6h后放入RNA专用柜中备用。

3、DEPC水的处理：用于处理枪头、试剂瓶盖和离心管等塑料制品的0.1%的DEPC水可以在
烧杯中配制，磁力搅拌器上搅拌过夜，搅拌过程中用锡箔纸封口。

用于配制RNA提取试剂的DEPC水需要在干烤过的试剂瓶中配制，盖上瓶盖搅拌过夜后121℃灭菌20min。

4、枪头、离心管和试剂瓶盖用0.1%DEPC水过夜处理后用报纸包好高温灭菌，移液器必须
是专用的，用之前用DEPC处理的水配制的75%酒精擦拭整个移液器，特别是枪杆。

超净台的处理：用DEPC处理的水配制的75%酒精擦拭干净后，用氯仿快速擦拭，再用75%酒精擦拭，将提取所需的物品放入超净台，并用75%酒精擦拭，另放置一个废物缸，表面喷酒精，上述完成后，超净工作台紫外灯照射15-20min。

试剂配制过程中所用的枪头也必须是DEPC水处理过并高温灭菌的。

5、提取过程中用新开封的氯仿和异丙醇，用DEPC水处理过的15mL离心管分装，每管分
装10mL并于4℃保存，最后溶解RNA沉淀的DEPC处理过的水用处理过的1.5mL离心管分装并于-20℃保存。

6、用专用的电泳槽电泳RNA，用DEPC处理的水配制50×TAE缓冲液，每次电泳前用DEPC
处理的水配制1×TAE缓冲液进行电泳，电泳前用去污剂将电泳槽、制胶板和梳子清洗干净，DEPC水配制的75%乙醇擦拭，最后用DEPC处理的水冲洗干净。

提取植物组织RNA的操作步骤
1、将RNase-free的离心管用镊子在超净台中取出并加入1mL trizol置于冰上，将新鲜采集
的植物幼叶用烘烤过的研钵在液氮环境下快速研磨成粉末，此过程中用到的剪刀、钥匙和镊子均是经过烘烤处理的。

研磨速度要快，一个样品尽量在1min内研磨完全，必须在液氮或低温下进行，将粉末加入trizol中后迅速在震荡仪上振荡20s，室温下放置5min。

2、加入200μL的氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈震摇30s，室温放置10min。

3、12000rpm，4℃离心15min，此时溶液分为三层，上层的水相，中间的DNA沉淀和下层
的有机相，小心缓慢吸取上层水相至新的离心管中，上清可以不用吸干净，但是一定不要吸到中间层和下层。

吸取上清的时候换新的手套。

4、加入等体积的异丙醇颠倒混匀后室温放置10min，12000rpm，4℃离心10min。

5、小心地倒掉上清，用1mL 75%的乙醇洗涤沉淀。

洗涤的过程可以用手指轻弹离心管，尽
量将沉淀弹起，并上下颠倒，使整个离心管内部被充分洗涤。

6、12000rpm，4℃离心5min，重复洗涤一次，将上清液尽量吸干后室温干燥2-3min。

7、加入20-50μL DEPC处理的水溶解RNA沉淀。

8、用0.1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，200V电泳10min。

9、RNA的保存：电泳检测时先将RNA溶液保存于-40℃，待电泳结束后根据实验需要决定
是否保存RNA，若需保存则将样品先用液氮速冻后用封口袋装好，于封口袋上标明日期和样品名称冻存于-80℃。

操作过程中的注意事项
1、研磨之前事先将研钵预冷，研磨过程中杵棒和研钵不要碰到其他未处理过RNase的物体。

在转移粉末至离心管中时速度一定要快，不能让粉末吸收空气中的水分而受潮，以防止被空气中的RNase降解。

2、在超净台中操作时每次需要用DEPC水配制的75%酒精擦拭手及新放入超净台中的物品，
操作过程中不能将皮肤任何地方暴露在超净台中。

3、吸取试剂时，枪杆不能插入试剂瓶中，慢吸慢打，吸取液体后的枪不能平放。

插好的枪
头若碰到了其他地方必须重新换枪头，用枪加样时必须悬空加，以免造成污染。

4、整个操作过程尽量快，操作过程中不能用手套、枪杆或其他物体碰到离心管口及内部，
以免造成污染。