16S rRNA 基因突变与结核分支杆菌耐链霉素的研究

・论著摘要・16S rRNA基因突变与结核分支杆菌耐链霉素的研究
吴雪琼　张俊仙　庄玉辉　张晓刚　李国利　何秀云　张军芝　贾树林
我们已证实大多数结核分支杆菌耐链霉素(S M)是由于其核糖体S12蛋白编码基因(rps L)错义突变所致[1],在此基础上,通过聚合酶链反应(PCR)2单链构象多态性(SSCP)和PCR2直接测序法(DS)进一步研究其16S rRNA编码基因(rrs)的突变情况,以探讨其应用价值。

材料与方法　从13种分支杆菌、7种非分支杆菌标准株及59株结核分支杆菌临床分离株中提取DNA,以引物I NS1和I NS2扩增结核分支杆菌复合群插入序列IS986产生245bp片段[2];以引物rrsl(5′2G CCTT CGGG TTG T AAAC)、rrs2 (5′2AG TT AAG CCG TG AG ATTT C A)和rrs3 (5′2G TG TGGG TTT CCTT CCTTGG)、rrs4(5′2 CG AC ACG AG CTG ACG AC AG)分别扩增结核分支杆菌rrs基因序列的415～614位和820～1067位,产生200bp(rrs上)和248bp(rrs下)片段。

rrs扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳进行SS2 CP分析。

分别以rrs2和rrs3为测序引物对SSCP泳动异常的rrs上和rrs下片段进行DS分析。

结果　(1)结核分支杆菌rrs基因PCR引物的特异性:引物rrs1、2可扩增结核、卡介苗、鸟、胞内、瘰疬、耻垢、偶然、母牛和浅黄分支杆菌DNA产生200 bp片段,不扩增迪氏、草、海和牛分支杆菌及表皮葡萄球菌、绿脓杆菌、假白喉杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肺炎球菌;引物rrs3、4可扩增上述所有分支杆菌,而上述非分支杆菌均扩增阴性。

(2)结核分支杆菌临床分离株的分析结果:用引物I NS1和I NS2
作者单位:100091北京,解放军第三○九医院结核病研究室(吴雪琼、张俊仙、庄玉辉、张晓刚、李国利、何秀云),放射科(张军芝、贾树林)扩增59株结核分支杆菌分离株,均产生
245bp片段,进一步证明这些分离株均
为结核分支杆菌。

28株药物敏感株的
rps L、rrs上和rrs下基因片段SSCP分析均
未见泳动异常。

31株耐S M分离株的
rps L和rrs基因分析发现:74%单有rp2
s L43位密码子突变[AAG(Lys)→AGG
(Arg)],3%有rrs突变,7%有rps L[43位
密码子(1株):AAG(Lys)→AGG(Arg),33
位密码子(1株):G T A(Val)→AT A(Lle)]
和rrs双重突变,rrs突变均为513位A→
C颠换,16%rps L和rrs未见突变。

讨论　rrs基因约1536bp,是个非
常保守的基因,在分支杆菌之间有很高
的同源性[3]。

本文的特异性试验结果表
明所设计的引物是分支杆菌属特异的。

国外几篇文献[4～9]报道的107株耐S M
分离株中,49%为rps L突变,29%为rrs
基因突变,rrs突变大多位于491、512、
513、516、904或905位,以905位的A→G
转换和513位A→C颠换为最常见,
019%rps L和rrs双重突变,23%未见基因
突变。

由此可见,本文rps L突变占绝对
优势,rrs突变较少见,双重突变的发生
率高于国外,可能系患者抗结核治疗方
案中S M应用时间较长,使分支杆菌一
个基因突变不足以耐受S M而发生第二
次基因突变。

尤其是1株rps L33位密码
子突变是否能引起S M耐药尚不可知。

rrs的513位突变在大肠杆菌通过基因工
程技术已被证明可导致S M高水平耐药
性产生。

少数结核分支杆菌耐S M分离
株有正常的16S rRNA和S12蛋白,却仍
显示对S M耐药,这提示存在其它耐药
机制,需进一步研究。

总之,大多数结核分支杆菌耐S M
是由于rps L基因突变所致,少数是由于
rrs基因突变所致。

PCR2SSCP和PCR2DS
是快速检测基因突变的有效方法,应用
其检测结核分支杆菌临床分离株中rps L
和rrs基因突变只需2～4天时间,可快
速检测大多数结核分支杆菌S M耐药
性,指导临床治疗。

参考文献
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(收稿:1998202225 修回:1998204207)
(本文编辑:汪谋岳)
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5
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中华结核和呼吸杂志1998年9月第21卷第9
期
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