KLK8通过调节EGF对结直肠癌细胞凋亡的影响及其机制

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《中国癌症杂志》2021年第31卷第5期
CHINA ONCOLOGY 2021 Vol.31 No.5基金项目：国家自然科学基金（81471852）；上海市自然科学基金（20ZR1412900）。

通信作者：许平波 E-mail: xupingboshanghai@
KLK8通过调节EGF对结直肠癌细胞凋亡的 影响及其机制
花　晴，申雪芳，许平波
复旦大学附属肿瘤医院麻醉科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032
［摘要］ 背景与目的：结直肠癌是中国常见的消化道恶性肿瘤之一。

组织激肽释放酶相关肽酶8（kallikrein-related peptidase 8，KLK8）是一种丝氨酸蛋白酶，其异常表达对多种肿瘤的发生、发展具有重要作用，但其对结直肠癌细胞凋亡的影响鲜有报道。

表皮生长因子（epidermal growth factor ，EGF ）可通过多种机制抑制细胞凋亡，在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。

探讨KLK8通过调节EGF 对结直肠癌细胞凋亡的影响及其机制。

方法：采用GEO 芯片数据集GSE21815、GSE37182和GSE71187分析结直肠癌组织中KLK8的表达水平。

采用KLK8质粒和KLK8 siRNA 构建结直肠癌细胞系RKO 和SW480细胞的KLK8过表达稳定转染细胞株和KLK8敲低细胞株，采用AnnexinⅤ-FITC/PI 双染法流式细胞术检测过表达前后结直肠癌细胞的凋亡。

以癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas ，TCGA ）数据库为基础，采用基因集富集分析法（gene set enrichment analysis ，GSEA ）下的“GO”基因集对KLK8高表达和低表达的结直肠癌组织进行基因表达分析。

采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA ）法检测过表达KLK8对EGF 蛋白水平的影响。

利用表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor ，EGFR ）siRNA 检测EGFR 敲低前后对RKO 和SW480细胞凋亡的影响。

结果：采用GEO 芯片数据集GSE21815、GSE37182和GSE71187分析发现，KLK8在结直肠癌组织中表达升高。

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染法流式细胞术发现，过表达KLK8的RKO 和SW480细胞凋亡减少，敲低KLK8结直肠癌细胞凋亡增多。

采用GSEA 分析发现，KLK8高表达与细胞外基质（extracellular matrix ，ECM ）的分解、表皮发育密切相关。

采用ELISA 法检测显示，在过表达KLK8的RKO 和SW480细胞上清液中，EGF 的表达明显升高。

随后在过表达KLK8的RKO 和SW480细胞中敲低EGFR ，发现细胞凋亡明显增多。

结论：KLK8可抑制结直肠癌细胞的凋亡，其可能通过促进EGF 蛋白的表达调节结直肠癌细胞的凋亡，从而促进结直肠癌的进展。

［关键词］ 结直肠癌；组织激肽释放酶相关肽酶8；表皮生长因子；凋亡DOI: 10.19401/ki.1007-3639.2021.05.004
中图分类号：R735.3+5; R735.3+7 文献标志码：A 文章编号：1007-3639(2021)05-0383-07
Effect of KLK8 on apoptosis of colorectal cancer cells by regulating EGF and its mechanism HUA Qing, SHEN Xuefang, XU Pingbo (Department of Anesthesiology, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)
Correspondence to: XU Pingbo E-mail: xupingboshanghai@
［Abstract ］ Background and purpose: Colorectal cancer is one of the most common gastrointestinal malignancies in China. Tissue kallikrein-related peptidase 8 (KLK8) is a serine protease. Its abnormal expression plays an important role in the occurrence and development of a variety of tumors, but its effect on apoptosis of colorectal cancer cells has rarely been reported. Epidermal growth factor (EGF) can inhibit cell apoptosis through a variety of mechanisms, and plays an important role in the occurrence and development of tumor. This study aimed to investigate the effect of KLK8 on apoptosis of colorectal cancer cells by regulating EGF and its mechanism. Methods: This study explored the relationship between KLK8 and clinicopathological features of colorectal cancer based on GEO public databases. KLK8 plasmid and KLK8 siRNA were used to construct stable KLK8 overexpression transfected and KLK8 knockdown cell lines using colorectal cancer cell lines RKO and SW480. Annexin Ⅴ-FITC/PI double staining was used to detect the apoptosis of colorectal cancer cells before and after KLK8 overexpression. Based on The Cancer Genome Atlas (TCGA) database, the “GO” gene set of gene set enrichment analysis (GSEA) was used to analyze the gene expression of KLK8 in colorectal cancer tissues with high and low expression. The effect of KLK8 overexpression on EGF protein level was
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结直肠癌是全球常见的恶性肿瘤之一。

近年来，由于化疗、免疫治疗和靶向治疗的飞速发展，结直肠癌患者的总生存率显著提升。

但由于其高发病率，结直肠癌仍是死亡率较高的恶性肿瘤之一［1-2］。

人组织激肽释放酶相关肽酶家族（kallikrein-related peptidases，KLKs）由KLK1~KLK15组成，是一组具有胰蛋白酶和糜蛋白酶样活性的丝氨酸蛋白酶［3-4］。

KLKs具有多种生物学功能，在血液凝固、补体激活、胚胎发育和伤口愈合等方面具有重要作用［5-7］。

作为KLKs家族的重要成员，KLK8是一种突触相关的丝氨酸蛋白酶，可参与多种生物活动如表皮增殖分化、角质形成等［8］。

近年来，越来越多的研究［6，9］表明，KLK8与肿瘤的发生、发展密切相关，其在卵巢癌［10］、宫颈癌［11］和肺癌［12］等多种肿瘤中均异常表达。

与此同时，越来越多的证据［13-14］证明，KLK8可作为肿瘤生存和预后的生物学标志物。

然而，KLK8对结直肠癌细胞凋亡的影响尚未可知。

为进一步探索KLK8促进结直肠癌细胞凋亡的机制，本研究利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库，通过基因集富集分析法（gene set enrichment analysis，GSEA），对KLK8高表达和低表达的结直肠癌组织进行基因表达分析。

结果发现，KLK8高表达与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的分解、表皮发育密切相关。

表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）由53个氨基酸残基组成，编码基因位于人类染色体4（4q25-27）上，可在多种正常细胞、人类癌组织中表达。

有研究［15-17］表明，EGF可以抑制肿瘤细胞的凋亡。

作为一种丝氨酸蛋白酶，KLKs具有水解多
种蛋白底物的能力，有研究［18］表明，KLK8可通过剪切激活EGF，促进心肌肥厚。

那么，KLK8是否可通过EGF途径对结直肠癌细胞的凋亡产生影响？本研究将探讨KLK8对结直肠癌细胞凋亡的调节作用及其机制，为进一步探索KLK8对结直肠癌的影响及其潜在机制奠定基础。

1 材料和方法
1.1 细胞培养与实验试剂
人胚肾上皮细胞HEK-293T、人结直肠癌细胞RKO和SW480均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，所有细胞均培养在DMEM培养基（美国Invitrogen公司）中，所有培养基均添加10%胎牛血清（美国Gibco公司）和1%青霉素/链霉素（美国Invitrogen公司）。

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）siRNA套装购自百奥生物技术（南通）有限公司，Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，KLK8质粒购自上海吉凯基因化学技术有限公司，嘌呤霉素购自美国Roche公司，ELISA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司，兔抗人KLK8多克隆抗体（货号：ab150395）购自英国Abcam公司，鼠抗人β-actin单克隆抗体（货号：sc-47778）购自美国Santa Cruz公司，山羊抗兔IgG二抗（货号：7076V）和山羊抗小鼠IgG二抗（货号：7074V）均购自美国Cell Signaling公司。

1.2 肿瘤基因组图谱分析与GSEA
GEO芯片数据集GSE21815、GSE37182和花　晴，等 KLK8通过调节EGF对结直肠癌细胞凋亡的影响及其机制
detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). siRNA of epidermal growth factor receptor (EGFR) was used to detect the apoptosis of RKO and SW480 cells before and after EGFR knockdown. Results: Using GEO microarray data sets GSE21815, GSE37182 and GSE71187, this study found that KLK8 expression was increased in colorectal cancer. Annexin Ⅴ-FITC/PI double staining flow cytometry showed that the apoptosis of RKO and SW480 cells with KLK8 overexpression decreased, while the apoptosis of KLK8 knockdown colorectal cancer cells increased. GSEA analysis showed that the high expression of KLK8 was closely related to the decomposition of extracellular matrix (ECM) and epidermal development. ELISA showed that the expression of EGF was significantly increased in the supernatant of RKO and SW480 cells overexpressing KLK8. Subsequently, knockdown of EGFR in RKO and SW480 cells overexpressing KLK8 resulted in increased apoptosis. Conclusion: KLK8 can inhibit the apoptosis of colorectal cancer cells. It may regulate the apoptosis of colorectal cancer cells by promoting the expression of EGF protein, so as to promote the progression of colorectal cancer.
［Key words］ Colorectal cancer; Tissue kallikrein-related peptidase 8; Epidermal growth factor; Apoptosis
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GSE71187从GEO官网（https://www.ncbi.nlm. /geo/）下载，用于比较结直肠正常组织和癌旁组织间的差异。

TCGA结肠癌（COAD）由275例结直肠癌和349名健康志愿者组成，从USUC Xena网站（https:/// datapages/?dataset=TCGA）下载。

为阐明KLK8在结直肠癌中的作用机制，在Broad Institute平台上进行GSEA，并将统计学显著性设为0.25。

利用“GO”基因集的方法，对KLK8高表达和低表达的结直肠癌数据进行基因表达差异分析，寻找KLK8的相关信号通路。

1.3 方法
1.3.1 质粒慢病毒包装
将HEK-293T以1×107个/10 cm培养皿的密度铺板。

次日进行质粒转染。

按照目的质粒（pcDNA3.1-KLK8质粒，上海吉凯基因化学技术有限公司）∶包装质粒psPAX2∶包装质粒pMd.2.G为2.0∶1.5∶0.5的比例，将3种质粒混合在500 μL无血清的Opti-MEM培养基中。

按照Lipofectamine TM3000产品说明书进行质粒转染。

48 h后收集上清液。

收集的病毒液经过滤器过滤后于-80 ℃储存。

将RKO和SW480细胞以1×105细胞/孔的密度放置在6孔板中，培养过夜。

细胞贴壁后，在细胞培养基中加入上述得到的病毒液。

感染24 h后去除病毒液，加入新鲜细胞培养基。

将2 µg/mL嘌呤霉素加入细胞培养基中，4周后产生稳定的KLK8过表达细胞系。

收集耐药细胞进行后续分析。

1.3.2 siRNA转染细胞
配制转染反应体系：siRNA与转染试剂的比例为1 μg∶1 μL，分别用125 μL Opti-MEM温育于Ependorf试管中，室温温育5 min，然后混合。

将RKO和SW480细胞以1×105个细胞/孔的密度铺板在6孔板中，培养过夜。

待细胞贴壁后，加入上述转染体系，感染24 h后换液，加入新鲜细胞培养基。

收集细胞进行后续分析。

1.3.3 蛋白质印迹法（Western blot）检测
按照十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶的配方制备合适浓度的SDS-PAGE凝胶胶板。

将制备好的SDS-PAGE胶板安装好。

加入电泳缓冲液后，加入50 μg蛋白样品到凝胶内的上样孔中，80 V电压电泳，电泳完毕后开始转膜，用甲醇激活聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，100 V转膜90 min。

转膜完成后，采用5%胎牛血清室温封闭1 h。

加入一抗KLK8（1∶1 000稀释）、β-actin（1∶5 000稀释），4 ℃摇床上温育过夜。

第2天用1×磷酸盐吐温缓冲液（phosphate buffered saline with Tween，PBST）洗膜5次，每次7 min，加入对应一抗种属来源的HRP标记的二抗（山羊抗兔IgG二抗和山羊抗小鼠IgG二抗均为1∶5 000稀释），在室温摇床上温育1 h，用1×PBST洗膜5次，每次7 min。

然后曝光成像。

1.3.4 Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡
计数铺RKO和SW480细胞，按照Annexin Ⅴ-F I T C/P I细胞凋亡检测试剂盒（货号：E606336）说明书处理细胞，处理好的细胞采用流式细胞术检测细胞凋亡。

1.3.5酶联免疫吸附测定（e n z y m e-l i n k e d immunosorbent assay，ELISA）法检测EGF表达收集RKO和SW480的细胞培养上清液，2 000~3 000 r/min离心20 min。

仔细收集上清液。

应用ELISA法检测细胞上清液中EGF的表达水平，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

每孔各加入标准品或待测样品100 μL，将反应板充分混匀后置于37 ℃ 40 min。

接着用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次，向滤纸上印干。

向每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50 μL（空白除外）。

将反应板充分混匀后置于37 ℃ 20 min。

然后用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次，向滤纸上印干。

每孔加酶标抗体工作液100 μL。

将反应板置于37℃10 min。

接着用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次，向滤纸上印干。

每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗处反应15 min。

每孔加入100 μL终止液混匀。

30 min内用酶标仪（型号：DENLEY DRAGON Wellscan MK 3）在450 nm处测吸光度（D）值。

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1.4 统计学处理
实验中所有统计分析均使用SPSS 13.0软件进行。

实验中所有的数据均以x ±s 表示，两个样本间比较均使用t 检验，多样本间用单因素方差分析检验。

P <0.05为差异有统计学意义。

2 结 果
2.1 结直肠癌中KLK8的表达情况
KLK8的表达与多种肿瘤的发生、发展密切相关［10，12］。

本研究采用GEO 芯片数据集GSE21815、GSE37182和GSE71187分析发现，与正常组织相比，结直肠癌组织中KLK8的表达显
著上调（图1）。

2.2 KLK8对结直肠癌细胞凋亡的影响
细胞凋亡异常是人类恶性肿瘤的特征［19］。

本研究通过构建KLK8过表达的RKO 和SW480细胞系稳定转染细胞株和敲低细胞株来判断KLK8表达升高或降低是否会影响结直肠癌细胞的凋亡，Western blot 检测证实已成功构建了KLK8过表达的RKO 和SW480细胞系稳定转染细胞株和敲低细胞株（图2A ）。

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染法流式细胞术来检测KLK8对结直肠癌细胞凋亡的影响，与对照组相比，KLK8过表达显著抑制结直肠癌细胞的凋亡（图2B 、C
）。

图 1 KLK8在结直肠癌中表达升高
Fig. 1 KLK8 is highly expressed in colorectal cancer
In the GSE21815, GSE37182 and GSE71187 databases, KLK8 was more significantly expressed in tumor tissues than in normal tissues. *: P <0.05, compared with normal tissues
图 2 KLK8过表达抑制结直肠癌细胞的凋亡
Fig. 2 KLK8 overexpression inhibited apoptosis of colorectal cancer cells
KLK8 overexpression was induced with recombinant lentivirus infection (Lv-KLK8) or KLK8 siRNA in human colorectal cancer cell lines RKO and SW480, and an empty adenovirus served as control (Lv-control). A: RKO and SW480 cells transfected with KLK8 overexpression vectors and KLK8 siRNA were validated at protein level by Western blot analysis. B: Cell apoptosis was determined by Annexin Ⅴ-FITC and PI double staining analysis using flow cytometry. Representative flow cytometry images were shown. C: The quantified data of cell apoptosis were also shown. Data were expressed as the x±s (n =3). **: P
<0.01, compared with Lv-control
花　晴，等 KLK8通过调节EGF对结直肠癌细胞凋亡的影响及其机制
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2.3 GESA分析KLK8表达抑制结直肠癌细胞凋亡的机制
为深入了解KLK8抑制结直肠癌细胞凋亡的机制，本研究利用TCGA 数据库，采用GSEA 对KLK8高表达和KLK8低表达结直肠癌组织中的基因表达
进行了分析。

结果显示，根据KLK8表达水平的不同，142条富集途径的表达存在差异，本研究选取差异最明显的前20条通路（图3A ，P <0.05）。

KLK8与ECM 的分解、表皮发育通路正相关，这两种通路与细胞凋亡密切相关（图3B
）。

图 3 结直肠癌中KLK8高低表达显著富集的通路
Fig. 3 Significantly-altered pathways were predicted in colorectal cancer depending on KLK8 expression
A: Gene sets enriched in the transcriptional profiles of tumors belonging to the top KLK8 high-expression group, compared with the bottom-expression group in the TCGA dataset. The normalized enrichment score values for each pathway using the GO gene sets were shown. The functional annotations of KLK8 positive and negative expressions in colorectal cancer were predicted. A nominal P <0.05 was considered statistically significant. B: GSEA highlighted positive association of increased KLK8 expression levels with epidermis development and extracellular matrix disassembly process
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图 4 KLK8通过激活EGF抑制结直肠癌细胞的凋亡
Fig. 4 KLK8 inhibited colorectal cancer cell apoptosis via the activation of the EGF
KLK8 overexpression was induced with recombinant lentivirus infection (Lv-KLK8) in the presence or absence of EGFR siRNA in RKO and SW480 cells. A: Expression of EGF in RKO and SW480 cell supernatants was determined by ELISA. B: RKO and SW480 cells transfected with EGFR siRNA were validated at protein level by Western blot analysis. C, D: Cell apoptosis was determined by Annexin Ⅴ-FITC and PI double staining analysis using flow cytometry. Representative flow cytometry images were shown in C. The quantified data of cell apoptosis were also shown in D. Data were presented as the x±s (n =3). **: P <0.01, compared with Lv-control; ##: P <0.01, compared with Lv-KLK8
花　晴，等 KLK8通过调节EGF对结直肠癌细胞凋亡的影响及其机制
2.4 KLK8抑制结直肠癌细胞凋亡的机制
作为一种丝氨酸蛋白酶，KLK8能切割并激活多种膜蛋白的细胞外部分，如EGF 。

EGF 与表皮发育、ECM 的降解密切相关［16-17］。

在过表达KLK8的RKO 和SW480细胞上清液中，EGF 的表达明显升高（图4A ），表明KLK8可以剪
切EGF 。

接下来，本研究探讨了EGF 的表达升高是否有助于KLK8在结直肠细胞中的抗凋亡功能。

在过表达KLK8的RKO 和SW480细胞中利用siRNA 敲低EGFR （图4B ），细胞凋亡明显增多（图4C 、D ），表明抑制EGFR 可以逆转KLK8的抗凋亡作用。

3 讨 论
结直肠癌是全球常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居高不下。

发病率居恶性肿瘤第3位，死亡率居第2位［20-21］。

因此，迫切需要研究结直肠癌的发病机制和分子生物学标志物，以促进结直肠癌的早期诊断、预后预测和制定有效的治疗策略。

KLK8参与肿瘤发展的多个阶段，如肿瘤的增殖、迁移和血管生成，与肿瘤的恶性行为密切相关［4，9，12］。

有研究［22］表明，KLK8可促进结直肠癌细胞的增殖和转移，但KLK8对结直肠癌细胞凋亡的影响及其机制尚未可知。

本研究通过GEO 数据库分析发现，KLK8在结直肠肿瘤中表达升高。

在结直肠癌细胞中过表达KLK8可抑制
结直肠癌细胞的凋亡，而敲低KLK8可促进结直肠癌的凋亡。

K L K s 具有水解多种底物的能力，如促表皮生长因子（pro-epidermal growth factor ， pro-EGF ）、蛋白酶激活受体（protease-activated receptor ，PAR ）和神经调节蛋白-1等［18］。

本研究通过GSEA 分析发现，KLK8高表达与表皮发育及ECM 的分解密切相关。

作为表皮发育的重要调节因子，EGF 是一种含有53个氨基酸残基的多肽，可与EGFR 结合，启动细胞内信号通路的级联反应。

因此，EGF 可参与多种生理学和病理学过程，包括细胞增殖、凋亡、迁移、存活和血管生成等［16-17］。

本研究显示，过表达KLK8的结直肠癌细胞上清液中，EGF 的表达量增多，表明KLK8可剪切结直肠癌细胞表面的pro-EGF ，释放
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EGF。

为进一步研究其对结直肠癌细胞凋亡的影响，本研究利用siRNA敲低EGF的细胞表面受体EGFR，采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染法流式细胞术检测结直肠癌细胞的凋亡情况。

结果发现，敲低EGFR后，结直肠癌细胞的凋亡增加，表明抑制EGFR可逆转KLK8抑制的结直肠细胞的凋亡，因此推测KLK8可通过剪切释放EGF，抑制结直肠癌细胞的凋亡。

本研究显示，KLK8在结直肠癌中表达升高。

过表达KLK8可抑制结直肠癌细胞的凋亡，敲低KLK8可促进细胞的凋亡。

KLK8可剪切释放EGF，敲低EGFR表达，阻断EGF调控信号通路可逆转KLK8对结直肠癌细胞凋亡的抑制作用。

本研究阐明了KLK8对结直肠癌细胞凋亡的影响及其潜在机制，为结直肠癌的分子靶向治疗提供了新线索。

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（收稿日期：2021-01-17 修回日期：2021-04-06）。