蛋白质等电点测定实验报告

蛋白质等电点测定实验报告
蛋白质等电点测定
蛋白质等电点测定及性质实验
一、目的：
了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。

初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。

二、原理：
固体颗粒在液体中为什么能够带电？
当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。

在界面上带电表面和反离子形成了双电层的结构。

在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。

对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。

最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。

根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。

其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层（或称滑移面）。

由于带电表面的吸引作用，
在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。

离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。

紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。

其余反离子则构成扩散层。

滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。

滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。

固体颗粒带电量的大小及测量方式？
ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。

ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。

一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。

对于蛋白质分子来说：
蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。

大部分蛋白质分子的表面都有很多亲水集团，这些集团以氢键形式与水分子进行水合作用，使水分子吸附在蛋白质分子表面而形成一层水合膜，具有亲水性；又由于蛋白质分子表面的亲水集团都带有电荷，会与极性水分子中的异性电荷吸引形成双电层。

而水合膜和双电层的存在，使蛋白质的分子与分子之间不会相互凝聚，成为比较稳定的胶体溶液。

如果消除水合膜或双电层其中一个因素，蛋白质溶液就会变得不稳定，两种因素都消除时，蛋白质分子就会互
相凝聚成较大的分子而产生沉淀。

在生活实践中，常利用蛋白质的胶体性质沉淀或分离蛋白质。

如做豆腐、肉皮冻就是利用蛋白质的胶凝作用。

蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中的氨基酸分子氨基形成-NH3+而带正电，在碱性溶液中羧基形成-COO-而带负电：
蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点（PI）。

其定义为：在某一pH的溶液中，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等时，呈电中性，此时溶液的pH称为该蛋白质的等电点。

等电点的应用：主要用于蛋白质等两性电解质的分离、提纯和电泳。

蛋白质等电点的测量方式：溶解度最低时的溶液pH。

在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低，且溶液变混浊。

蛋白质在等电点时溶解度最小，最容易沉淀析出。

蛋白质等电点的测定
各种蛋白质的等电点都不相同，但偏酸性的较多，如牛乳中的酪蛋白的等电点是4.7~4.8，血红蛋白等电点为6.7~6.8，胰岛素是5.3~5.4，鱼精蛋白是一个典型的碱性蛋白，其等电点在pH 12.0~12.4。

本实验采用蛋白质在不同pH溶液中形成的混浊度来确定，即混
浊度最大时的pH值即为该种蛋白质的等电点值，这个方法虽然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作也简便。

蛋白质的等电点比较准确的方法是采用等电聚焦技术加以准确测定，但需一定的实验条件。

等电聚焦电泳（IEF，isoelectric focusing electrophoresis）
利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），形成一个很窄的区带。

IEF的基本原理
在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。

如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。

同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。

可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。

沉淀反应：蛋白质在某种理化条件下，蛋白胶体溶液的水化层或者电荷层破坏，蛋白胶体相互聚集的现象。

主要的沉淀现象有
（1）盐析：在蛋白质水溶液中加入足量的盐类（如硫酸铵），可析出沉淀，稀释后能溶解并仍保持原来的性质，不影响蛋白质的活性。

这是一个可逆的过程，可用于蛋白质的分离与初级提纯。

（2）变性：在重金属盐、强酸、强碱、加热、紫外线等作用下，引起蛋白质某些理性质改变和生物学功能丧失。

这是一个不可逆过程。

（3）加入一定量的溶剂如乙醇、丙酮，它们与蛋白质分子争夺水分子，破坏水化膜，短时间内是可逆反应；（4）加入生物碱试剂（含氮的碱性物质）：能使生物碱沉淀或作用产生颜
色反应的物质，称为生物碱试剂。

当溶液的pH小于PI时，蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合而生成沉淀。

酪蛋白是牛奶蛋白质的主要成分，常温下在水中可溶解0.8~1.2%，微溶于25度水和有机溶剂，溶于稀碱和浓酸中，能吸收水分。

当浸入水中则迅速膨胀。

在牛奶中以磷酸二钙、三钙或两者的复合物形式存在。

构造极为复杂，没有确定的分子式。

分子量约为57000~375000，在牛奶中约含3%，占牛奶蛋白质的80%。

三、器材及试剂：
1．器材：
①试管1.5×厘米（×9）。

②吸管1毫升（×2），2毫升（×2），10毫升（×2）。

③容量瓶50毫升（×2），500毫升（×1）。

④试管架。

2．试剂：
①0.01mol·L-1醋酸溶液。

③1 mol·L-1醋酸溶液。

④1 mol·L-1氢氧化钠溶液（氢氧化钠和醋酸溶液的浓度要标
定）。

⑤酪蛋白。

②0.1mol·L-1醋酸溶液。

四、操作步骤：
1．制备蛋白质胶液
（1）称取酪蛋白3克，放在烧杯中，加入40℃的蒸馏水。

（2）加入50毫升1 mol·L-1氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。

将溶解好的蛋白溶液转移到500毫升容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。

（3）在容量瓶中再加入1 mol·L-1醋酸溶液50毫升，摇匀。

（4）加入蒸馏水定容至500毫升，得到略现浑浊的，在0.1 mol·L-1NaAC溶液中的酪蛋白胶体。

2．等电点测定
按下表顺序在各管中加入蛋白质胶液，并准确地加入蒸馏水和各种浓度的醋酸溶液，加入后立即摇匀。

观察各管产生的混浊并根据混浊度来判断酪蛋白的等电点。

观察时可用+，++，+++，表示浑浊度。

3. 蛋白质性质实验（1）蛋白质的盐析
在试管里加入1~2毫升蛋白质的水溶液，然后逐滴加入硫酸铵饱和溶液，观察现象，有无白色浑浊产生。

滴加过程中不要摇动试管，现象不明显时，多加几滴硫酸铵饱和溶液。

（2）蛋白质的变性
在试管里加入2毫升蛋白质的水溶液，沸水浴加热5分钟，观
察现象。

把试管里的下层物质取出一些放在水里，观察现象。

在试管里加入3毫升蛋白质的水溶液，加入1毫升硫酸铜溶液，观察现象。

（有无淡蓝色絮状浑浊沉淀产生）。

把少量沉淀放入盛有蒸馏水的试管里，观察沉淀是否溶解。

五、思考题
1、在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低？请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。

在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。

2、本实验中，酪蛋白质在等电点时从溶液中沉淀析出，所以说凡是蛋白质在等电点时必然沉淀出来。

这种结论对吗？为什么？
不一定会沉淀，因为蛋白质表面有亲水基团，只是在等电点的时候颗粒无电荷间的排斥作用,易凝集成大颗粒，因而最不稳定，溶解度最小，易沉淀析出。

3、在分离蛋白质时等电点有何实际应用意义？
篇二：蛋白质的等电点测定和沉淀反应
实验3 蛋白质的等电点测定和沉淀反应
一、目的
1、了解蛋白质的两性解离性质。

2、学习测定蛋白质等电点的一种方法。

3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。

4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。

二、原理
蛋白质是两性电解质。

在蛋白质溶液中存在下列平衡：
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。

当溶液的PH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。

不同蛋白质各有特异的等电点。

在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。

最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。

本实验通过观察不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。

用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同pH值的缓冲液。

向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。

在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。

蛋白质的沉淀反应可分为两类。

（1）可逆的沉淀反应此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来溶剂中，并保持其天然性质而不变性。

如大多数蛋白质的盐析作用或
在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。

提纯蛋白质时，常利用此类反应。

（2）不可逆沉淀反应此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。

加热引起的蛋白质沉淀与凝固。

蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。

蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。

因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。

三、材料、试剂与器具（一）材料
新鲜鸡蛋（二）试剂
1、0.4%酪蛋白醋酸钠溶液200ml
取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200mL锥形瓶内，用少量40—50℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。

加入10mL 1mol/L醋酸钠溶液。

把锥形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。

将锥形瓶内的溶液全部移到100mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。

2、1.00mol/L 醋酸溶液100mL
3、0.10 mol/L醋酸溶液300mL
4、0.01 mol/L醋酸溶液50mL
5、蛋白质溶液500mL 5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清：水=1:9）
6、pH4.7醋酸—醋酸钠的缓冲溶液100mL
7、3%硝酸银溶液
10mL 8、5%三氯乙酸溶液50mL 9、95%乙醇250mL 10、饱和硫酸铵溶液250mL 11、硫酸铵结晶粉末10000mL 12、0.1mol/L盐酸溶液300mL 13、0.1mol/L氢氧化钠溶液300mL 14、0.05mol/L碳酸钠溶液300mL 15、甲基红溶液20mL （三）器具
1、水浴锅
2、温度计
3、200mL锥形瓶
4、100mL容量瓶
5、吸管
6、试管及试管架
7、7、乳钵四、操作步骤
（一）酪蛋白等电点的测定
（1）取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。

（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。

此时1、2、3、4管的pH依次为5.9、5.5、4.7、3.5。

观察其混浊度。

静置10分钟后，再观察其混浊度。

最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电点。

（二）蛋白质的沉淀及变性
1、蛋白质的盐析无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。

盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。

如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。

由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。

加蛋白质溶液5mL于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。

倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管内容物过滤，向滤液中添加
硫酸铵粉末到不再溶解为止。

此时析出沉淀为清蛋白。

取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。

2、重金属离子沉淀蛋白质重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。

取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加3%硝酸银溶液1—2滴，振荡试管，有沉淀产生。

放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？
3、某些有机酸沉淀蛋白质取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加入1ml5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。

放置片刻倾出清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。

4、有机溶剂沉淀蛋白质取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入2mL95%乙醇。

观察沉淀的生成（如果沉淀不明显，加点NaCl，混匀。

振摇混匀后，观察各管有何变化。

放置片刻向各管内加入水8毫升，然后在第2，3号管中各加一滴甲基红，再分别用0.1mol/L 醋酸溶液及0.05mol/L碳酸钠溶液中和之。

观察各管颜色的变化和沉淀的生成。

每管再加0.1mol/L盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。

解释各管发生的全部现象。

五、注意事项
等电点测定(来自: 写论文网:蛋白质等电点测定实验报告)的实验要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确。

六、实验报告
以表格形式总结实验结果，包括观察到的现象，分析评价实验结果。

七、思考题
1、什么是蛋白质的等电点？
2、在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？
篇三：蛋白质的等电点测定及性质实验
蛋白质的等电点测定及性质实验
一、实验目的
初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，并了解蛋白质的性质。

二、实验原理
蛋白质分子是两性电解质，当调节溶液的酸碱度，使蛋白质分子上所带的正负电荷相等时，在电场中，该蛋白质分子既不向正极移动，也不向负极移动，这时溶液的pH值，就是该蛋白质的等电点（pI）。

不同蛋白质，等电点不同。

在等电点时，蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。

因此，可以借助在不同pH溶液中的某蛋白质的溶解度来测定该蛋白质的等电点。

在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐，蛋白质即从溶液中沉淀析出，这种作用称为盐析。

盐析法常用的盐类有硫酸铵、硫酸钠等。

蛋白质的盐析作用是可逆过程。

由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解。

而重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。

三、试剂和器材
⑴高筋面粉、低筋面粉。

⑵1mol/L醋酸。

（每组自配0.1mol/L醋酸、0.01mol/L醋酸）⑶
0.5%酪蛋白溶液。

称取2.5克酪蛋白，放入烧杯中，加入40℃的蒸馏水，再加入50毫升1N氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。

将溶解好的蛋白溶液转到500毫升容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。

在容量瓶中再加入1N醋酸溶液50毫升，摇匀，再加蒸馏水定容至500毫升，得到略显混浊的、在0.1N NaAc溶液中的酪蛋白溶液。

⑷鸡蛋白溶液。

将80mL鸡蛋清与800mL蒸馏水混合均匀后，用洁净的多层湿纱布垫在漏斗上过滤，滤液即为鸡蛋白溶液（不能有不溶性物悬浮）。

要现配现用，最好使用经过煮沸并封在容器中隔绝空气冷却的蒸馏水。

⑸质量分数为5%的CuSO4溶液。

（每排3组合配）⑹(NH4)2SO4饱和溶液。

（确保有固体析出）⑺天平、水浴锅、移液管、试管等。

四、操作步骤
1、蛋白质的等电点测定
⑴取5支同种规格的试管，编号，按表1顺序精确加入各种试剂，特别注意0.5%酪蛋白溶液最后加入，然后逐一振荡试管，使试管混合均匀。

此时1、2、3、4、5管的pH值依次为5.9、5.3、
4.7、4.1、3.5。

⑵将上述试管静置于试管架上15min后，仔细观察，比较各管的浑浊度，将观察的结果记录于表格内，并指出酪蛋白的等电点。

注意：本试验各种试剂的浓度及用量均要求很准确，确保缓冲液的pH值准确；浑浊度可用－、＋、＋＋、＋＋＋等符号表示，最混浊的一管的pH值即为酪蛋白的等电点。

3、当实验结果与已知发生较大误差时，试着分析其原因。