耐锰细菌鉴定与锰胁迫下的生理响应

耐锰细菌鉴定与锰胁迫下的生理响应
作者：田群许瑶喻昌燕王嘉福冉雪琴
来源：《山地农业生物学报》2017年第03期
摘要：为了探究细菌对锰的适应机制，从松桃的锰冶炼区寨英镇采集的土样中分离得到7株耐锰能力达到1800mg/L的细菌，其中S7和S16两株菌对锰的耐受能力高达2200mg/L。

形态学、生理生化和16S rDNA 基因测序等分析结果表明，这些菌分属于根癌土壤杆菌、沙福芽孢杆菌、根瘤菌属和氧化节杆菌。

在锰胁迫条件下，测定菌株S7的生长曲线、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性和电导率。

结果表明：在无锰条件下，细菌的生长速度很快，14～18小时后就进入稳定期，在锰胁迫条件下，菌株的生长速度明显减慢，S7菌株的SOD、CAT酶活性在10～18小时时升高，但电导率变化不大。

推测耐锰细菌可能通过上调氧化还原酶的活性适应锰胁迫。

这对揭示细菌耐受锰的生理机制和锰污染的微生物修复技术奠定理论基础。

关键词：锰抗性细菌；超氧化物歧化酶；过氧化氢酶；锰适应
中图分类号：Q93-3
文献标识码：A
文章编号：1008-0457（2017）03-0023-06国际DOI编码：
10.15958/ki.sdnyswxb.2017.03.004
Abstract：In order to explore the mechanism of the adaptation of bacteria to manganese，seven strains of bacteria were isolated from the soil samples collected from a manganese smelting area in Zhaiying town of Songtao County，Guizhou ProvinceThese bacteria could survive in medium with Mn2+ concentration of more than 1800mg/L，with two strainsS7 and S16 tolerance of Mn2+ concentration up to 2200mg/LThese strains were classified into Agrobacterium tumefaciens，Bacillus safensis，Rhizobium spand Arthrobacter oxydans based on the morphology，physiology，biochemical characters and 16S rDNA gene sequencesUnder the condition of manganese stress，the growth curves，the activities of superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT） and the conductivity of strain S7 were determinedThe results showed that strain S7 bacteria grew very fast under no Mn stress conditions and reached steady growth period after 14 to 18 hoursThe growth of S7 was clearly slowed down under the Mn stress conditionsThe enzyme activities of SOD and CAT reached their peaks after 1018 hours while the conductivity was unchangedIt is speculated that manganeseresistant bacteria may adapt to manganese stress by upregulating the activity of oxidoreductaseThis would provide the theoretical basis for revealing the physiological mechanism of bacteria tolerance to manganese stress and microbial remediation of manganese pollution
Key words：manganeseresistant bacteria；superoxide dismutase；catalase；manganese adaptation
貴州省松桃苗族自治县的锰矿资源丰富，是我国三大锰矿基地之一，与相邻的湖南花垣、重庆秀山形成我国有名的“锰三角”[1]。

随着锰矿的开采、冶炼，化肥制造和医药生产以及工业废水排放等日益增多，水体和土壤中的锰含量日趋增多[2-4]，“锰三角”地区地下水的锰含量达到832±034mg/L，远远超过国标饮用水标准01mg/L[《生活饮用水水质卫生规范》（GB5749-2006）]，超标率高达798%。

由于重金属的不可降解性，土壤中的重金属通过地下水和食物链可长期威胁人类和野生动物的安全，因此锰是矿区周边广泛存在的环境污染物[5]。

每一种重金属只要超过了环境容量限度，都是有害的甚至是有毒的[6]。

锰是生物体必需的微量元素之一，可作为多种酶的辅因子，为脂质、蛋白质等代谢所需要[7-8]，但当水中锰含量超过
01mg/L时就会对人体造成危害，食用锰超标的水和食物可导致生物机体慢性中毒，造成肝脏、肺等内脏器官的损伤[9-11]。

生物除锰技术中的微生物修复技术具有操作简单、速度快、吸附容量大并且处理低浓度重金属的效果好，愈来愈受到研究者的关注[12]。

本文从矿区分离耐锰菌，研究菌株对锰胁迫的应答和适应机制，以期为土壤和水体锰污染的细菌修复技术奠定理论基础。

1材料与方法
11实验材料
锰污染土样采自松桃县寨英镇锰冶炼区。

除去土壤表面的动植残渣，按四分法[13]采集0～20cm深度的土样，样品保存于自封袋，带回实验室进行细菌分离。

培养基：试验用MnCl2·4H2O为国产分析纯试剂，配制505Mm/L的MnCl2·4H2O母液，过滤除菌。

PYCM培养基：胰蛋白胨08g，酵母浸出粉02g，K2HPO401g，
MgSO4·7H2O02g，NaNO302g，CaCl201g，（NH4）2CO301g，蒸馏水1L，调节pH68～70，10×105 Pa灭菌15min。

固体培养基加入琼脂 2%。

12试验方法
121耐锰细菌的分离及纯化称取1g土壤样品加入到250mL三角瓶中，加入9mL无菌水用磁力搅拌珠振荡5～10min，土壤颗粒均匀分散于无菌水，静置15min，吸取80μL上清液涂布于PYCM（Mn2+：200mg/L）平板上，28℃倒置培养。

挑选菌落形态有差异，菌落特征典型、长势较好的菌落，平板划线法分离纯化2～3次。

挑取单菌落于PYCM液体培养基中，28℃，180 rpm培养24～48h，15%甘油保种。

逐渐增加培养基中重金属的浓度（700mg/L、800mg/L、1000mg/L直至2200mg/L），将初筛到的细菌接种于高浓度的锰盐培养基中，28℃，倒置培养，编号并保存高耐受菌株。

122耐锰细菌的生理生化检验将各菌株划线法接种于PYCM培养基上，28℃培养2d。

观察细菌菌落的形状大小、颜色、表面是否隆起和透明度。

挑取针眼大小的单菌落于载玻片进行革兰氏染色，油镜观察细菌菌体的形态。

对细菌进行淀粉水解、糖发酵、M-R、V-P、过氧化氫酶试验、分化的柠檬酸盐试验、吲哚试验和明胶液化等生理生化试验。

各项生理生化试验的判断参照生化鉴定管的颜色变化说明书和《常见细菌系统鉴定手册》[14]。

123耐锰细菌的分子系统学鉴定采用细菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）对分离到的7株高耐受细菌的16S rDNA基因进行PCR 扩增。

扩增反应体系（20μL）：2×Taq PCR Mix 10μL；基因组DNA15μL；上下游引物（10μmol/L）各05μL；无菌水75μL。

扩增条件94℃预变性5min；94℃ 30s；55℃ 30s； 72℃ 1min；30循环，72℃ 10min，4℃保存。

扩增产物用10%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物由英潍捷基公司（上海）测序。

以鞘氨醇杆菌属[15]为外群，用 MEGA5软件的邻接法构建系统发育树（NeighborJoining tree），系统发育树可靠性检测的自举值设定为1000次。

124高耐受细菌对锰盐的生理适应选取一株高耐受细菌进行锰盐适应性研究。

将菌株培养至对数期作为种子液。

在150mL/250mL PYCM液体培养基中接种对数期的种子液75mL，加入MnCl2·4H2O母液，使Mn2+的终浓度为250mg/L、500mg/L，28℃、180rpm培养，以未加Mn2+组为对照。

检测生长曲线、CAT、SOD酶活及电导率等指标。

其中SOD酶活性测定采用黄嘌呤氧化酶法测定，氧化氢酶酶活性测定采用钼酸铵法，试剂均由南京建成生物工程研究所提供；电导率的测定则取细菌菌液各1mL放入烧杯中，加入20mL去离子水，25℃下静置
10h。

再将试管放入100℃沸水中恒温水浴15min，待其冷却至25℃时，恒温测定煮沸液电导率。

电解质相对渗透率（%）=（处理液电导率值/煮沸液电导率值）×100%。

2结果与分析
21锰耐受细菌的生理生化特性鉴定
用平板划线法分离得到7株细菌，耐受能力达到1800mg/L，编号分别为S1、S2、S7、
S15、S16、S20和S23，其中S7和S16耐受锰的浓度高达2200mg/L。

生理生化鉴定结果见表1。

由表可知，菌株S7呈革兰氏染色阳性棒状杆菌，接触酶阳性，硝酸盐还原阳性，能分解
H2S、水解明胶，能利用葡萄糖氧化发酵，水解淀粉能力弱，与芽孢杆菌属的生理生化特性相符；S15菌株菌落呈圆形，菌落突起，经革兰氏染色后菌体呈红色杆状，水解淀粉的能力弱，能利用赖氨酸、鸟氨酸作为氮源，符合根瘤菌属的生理生化特性；S20呈革兰氏阳性球菌，接触酶阳性，葡萄糖、乳糖发酵不产酸，能水解明胶，根据细菌的形态特征及其生理生化特征，初步将S20菌株鉴定为节杆菌属；S1、S2、S16和S23菌落呈乳白色圆形、突起、边缘整齐、表面光滑，均为革兰氏阴性杆菌，可利用葡萄糖作为碳源，水解淀粉能力弱，部分种需要添加氨基酸，根据细菌的形态特征及其生理生化特征，初步将这四株菌鉴定为土壤杆菌属。

22锰耐受细菌的分子系统学鉴定
提取各菌株的基因组DNA为模板，采用通用引物扩增16S rDNA基因序列，得到约1400bp的片段（图1），经测序，S1、S2、S16和S23的目的序列与根癌土壤杆菌
（HM_756197）的相似性最高，为99%；S7与沙福芽孢杆菌（NR_041794）的相似性达99%，S15与根瘤菌（NR_043985）的相似性为98%；S20与氧化节杆菌（NR_026236）的相似性达99%。

在此基础上，构建了S1、S2、S7、S15 、S16、S20和S23的系统发育树（图2）。

23高耐受细菌的生理响应
231生长曲线菌株S7于250mg/L和500mg/L锰浓度的条件下培养，测定生长曲线（图3）。

对照组细菌的生长速度很快，5h后进入对数生长期，14～18h后就进入平台期。

在锰浓度为250mg/L和500mg/L的条件下，细菌的生长明显减慢。

从图中可以看出250mg/L的细菌生长量约为对照组的一半，500mg/L的条件下细菌的生长更慢。

232电导率的变化250mg/L和500mg/L的锰胁迫细菌，其电导率基本无差异。

表明该株细菌能适应低浓度锰的环境，细菌的细胞膜没有受损。

233超氧化物歧化酶活性Mn2+对细菌S7的SOD活性的影响都呈现先上升后下降的趋势，不同浓度的重金属锰的影响程度相似。

在有锰胁迫的条件下，培养10h后，SOD活性开始上升，14h达到峰值，之后下降。

在0～10h，细菌S7的SOD酶活性比率约为1左右，说明低浓度锰可促进SOD发挥活性。

234过氧化氢酶活性Mn2+对细菌S7的CAT活性的影响都呈现先上升后下降的趋势（图6），当Mn2+胁迫14h时，CAT活性相对于对照组其比率明显增加，到14h达到峰值后开始下降。

在有锰条件下，低浓度锰促进细菌S7的SOD发挥酶活性，SOD把氧自由基还原成
H2O2，当环境中H2O2含量增加时，则会刺激菌体分泌更多的CAT。

则菌株S7的CAT活性比对照组的高，其与对照组的比率约在1左右。

3结论与讨论
近年来，国内外科研工作者开展了抗锰微生物的筛选与利用的科研工作，在微生物除锰研究中，多种细菌已被发现对锰离子有较好的耐受性和去除能力。

从北京昌平锰矿旧址分离到1株锰氧化蜡样芽孢杆菌CP133，其能在锰含量为10mmol/L环境中生长[16]；在陕西南宝锰矿尾矿土样中分离得到的抗锰刺疣链霉菌，其抗锰最高质量浓度达40mg/L [17]；从天津市西青区锰污染土壤中分离到的锰氧化菌Bacillus spMKS-1，其最低抑制浓度为20mmol/L [18]；从黑龙江省红旗农场富含高铁高锰污染物的地下水井分离得到1株能够氧化铁锰的蜡状芽孢杆菌，能在锰含量为200mg/L的环境中生长 [19]。

本研究从松桃县锰冶炼区分离得到7株耐锰细菌，
它们的耐受锰浓度均能達到1800mg/L，其中S7和S16的耐受能力高达2200mg/L，显著高于前文所述的耐受锰浓度，但低于Aminobacter spH1（锰耐受浓度高达50mmol/L）[20]。

依据细菌16S rDNA分子鉴定，并结合细菌的菌落形态、革兰氏染色和生理生化特征最终确定细菌的种属名，其中S1、S2、S16和S23和鉴定为根癌土壤杆菌，S15为根瘤菌，S7为沙福芽孢杆菌，S20为氧化节杆菌。

耐锰细菌由污染的土壤和水体中分离得到，细菌的耐受能力差异很大，从污染严重地区分离得到的细菌耐受能力普遍偏高。

本文分离的细菌对锰的耐受性高于沙雷氏菌KM01、刺疣链霉菌、Bacillus spMKS-1和状芽孢杆菌P1等菌株，这对扩充优良抗性的细菌及对锰污染的微生物修复提供基础及重要作用。

生命体在受到重金属或高温等不利环境胁迫时，会产生活性氧自由基，如过氧化氢、超氧化物和羟基自由基，诱导体内的脂质过氧化反应[21-23]。

本研究通过检查细菌生长能力、SOD、CAT酶的活性变化来反映细菌对于重金属环境的一种适应性，从生理上揭示其耐受的机理。

通过对高耐受锰的S7菌株的生理应答研究发现，细菌在没有锰的环境中生长快，8h后就进入稳定期，在锰浓度为250mg/L条件下的生长量约0mg/L时的一半，500mg/L条件下细菌的生长速度更慢；说明高浓度的锰不利于细菌的生长；细菌在受到250mg/L锰胁迫时，电导率变化不大，提示细胞膜的通透性基本无变化，说明低浓度的锰胁迫对细菌细胞膜的损伤不大，细胞膜能够屏蔽外界对细菌生长的不利因素；细菌的SOD和CAT活性在锰胁迫14h达到峰值，说明细菌受锰胁迫后，细菌的氧化还原酶活性上调，并且可以提高细菌对锰胁迫的适应性并存活下来。

研究表明，SOD可以提高微生物受到的氧化应激刺激，在重金属胁迫中发挥重要的保护作用[24-25]。

氧自由基可与DNA碱基或者脱氧核糖骨架等细胞成分相互作用，形成8-OH-dG致使碱基突变或DNA链断裂，并且可氧化脂质或蛋白质，导致蛋白质变性，影响细胞的生存[26]。

细菌中SOD和CAT活性升高有利于清除氧自由基，SOD能清除，将其还原成H2O2，而CAT则能有效地把H2O2转化成H2O和O2，降低氧自由基的毒性，减小Mn2+的毒害作用，增强细菌对Mn2+的耐受性和适应性。

菌株S7在高浓度的锰盐胁迫时，能够生存，并形成S形的生长曲线，间接证明，细菌中的CAT和SOD升高对细菌起到了保护作用。

从松桃县的锰冶炼区寨英镇采集的土样中分离得到7株高耐锰细菌，结合细菌形态特征，生理生化特性和分子系统学分析，S7菌株鉴定为沙福芽孢杆菌，S15为根瘤菌属细菌，S20为氧化节杆菌，S1、S2、S16和S23鉴定为根癌土壤杆菌。

对高耐受菌株S7进行锰盐胁迫，发现在无锰条件下，细菌的生长速度很快，在有锰条件下，生长相对较慢，细菌在锰浓度
250mg/L条件下的生长量约为无锰条件的一半；菌体受锰胁迫后，细胞通过SOD、CAT酶活性的改变，维持细胞的正常生理状态。

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