分子生物学讲座(9)
分子生物学全套课件96P课件精品文档
Molecular Biology
Presumed that you have learned “Molecular Biology” before your receiving the Bachelor’s Degree of Sciences;
Designed for helping you to become associated with the most researching interests (areas) of our university;
+
lucifCAAAACCCC
luciferase
Light + oxylufiferin
AC G TG
Pyrograph
Recorded by computer
dNTP added in serial
Sequencing by ligation: Applied Biosystems
polony
20 microns
Position overlapped one base one image color order = base adding order = sequence
Reversible terminators: Illumina
Bridge amplification of DNA fragments is randomly distributed across eight channels of a glass slide, to which high-density forward and reverse primers are covalently attached. The solid-phase amplification produces ~80 million molecule clusters (MCs) from individual ssDNA templates. A primer is annealed to the free ends of templates in each MC. The polymerase extends and then terminates DNA synthesis from a set of four reversible terminators (RTs), each labeled with a different dye. Unincorporated RTs are washed away, base identification is performed by four-colour imaging, and blocking and dye groups are removed by chemical cleavage to permit the next cycle. Colour images for a given MC provide reads of ~45 bases. Substitutions are the most common error type.
分子生物学课件ppt
转基因技术
转基因技术是将外源基因导入生物体，实现基因的过 表达或补充。转基因技术的关键在于选择合适的载体 和导入方法。
THANKS
感谢观看
基因编辑技术的应用
基因编辑技术在许多领域都有广泛的应用，如罕见病治疗、癌症免疫治疗、农业育种等。 通过基因编辑技术，可以实现对特定基因的敲除、敲入或修饰，以达到治疗或改良的目的 。
基因编辑技术的伦理问题
虽然基因编辑技术具有巨大的潜力，但也引发了伦理和法律等方面的争议。在应用基因编 辑技术时，需要充分考虑伦理和法律问题，确保技术的合理应用和规范发展。
发展趋势
基因组学、蛋白质组学、代谢组学等 多组学研究，跨学科交叉融合，生物 信息学和计算生物学的发展等。
02
分生物学基本概念
基因与DNA
基因
基因是生物体内携带遗传信息的最小 单位，负责编码蛋白质或RNA分子 。
DNA
DNA是生物体的主要遗传物质，由四 种不同的脱氧核苷酸组成，通过特定 的序列排列储存遗传信息。
高通量测序
高通量测序是指一次可以对大量DNA或RNA分子进行序列测定的技术。高通量测序技术极大地提高了 基因组学和转录组学研究的效率，为生物医学研究提供了强大的工具。
04
分子生物学应用
生物医药研究
01
02
03
药物设计与开发
利用分子生物学技术，研 究药物与靶点的相互作用 ，提高药物的疗效和降低 副作用。
分子生物学前沿研究
表观遗传学研究
01
表观遗传学研究
表观遗传学是研究基因表达的调控机制，通过研究DNA甲基化、组蛋
白修饰等机制，揭示基因表达的调控规律，以及环境因素对基因表达的
影响。
02
《分子生物学》讲稿
《分子生物学》讲稿课程简介课程编号：总学时数：80 周学时:6开课学期：第7学期学分：5本课程是生物科学专业一门重要的专业基础课，主要内容是通过对分子生物学的基本概念、基本理论和基本技能进行系统的阐述，注重学科体系的建立和发展过程，以DNA的结构及功能为主线，以基因表达及调控为视点，加大利用科学实验理解分子生物学概念和理论的内容，把基础知识和前沿技术有机地结合在一起。
考试方式：闭卷考试预修课程：生物化学、细胞生物学教材：现代分子生物学（第三版），朱玉贤等(注：为专科学习时采用的教材)Gene VIII （Benjamin Lewin主编）(注：为接本时的补充教材)教学参考书：1 ．Molecular Biology of the Cell (4th Edition by B Alberts)2．Molecular Cell Biology (4th Edition by H Lodish)3．Molecular Biology (2nd Edition by R Weaver)4．分子生物学(Instant Notes in Molecular Biology, 2nd Edition by P Turner）5．Advanced Molecular Biology (by R Twyman)6. 分子细胞生物学（第二版），韩贻仁，山东大学出版社7. Genomes 2, T. A.布朗著，袁建刚等译，科学出版社学时分配表理论课65学时章次内容学时一绪论 3二 DNA是遗传物质 3三 DNA的结构 3四 DNA复制和分子杂交 6五基因突变和修复8六遗传重组 8七基因组及基因作图8八基因转录和RNA加工 9九蛋白质合成 6十基因表达调控 9《分子生物学》理论课程内容课程要求: 按照知识点进行介绍;不拘泥于形式;互相学习，可以随时打断，随时质疑;要求能够在掌握一些知识的情况下熟悉分子生物学的基本原理和技术;要能够提出问题和建议;能自己进行实验设计和结果分析1 绪论［基本要求］通过本部分的学习，学生应对分子生物学的主要研究内容有一个全面系统地了解，对分子生物学的主要研究对象（基因、基因组、染色体）有一个全面的了解。
分子生物学(全套课件557P)
分子生物学（全套课件557P）简介分子生物学是研究生物分子结构、功能和相互作用的学科。
它涉及到核酸、蛋白质和其他生物分子的研究，以及它们在细胞和生物体中的功能。
本文档是一套全面的分子生物学课件，共有557页。
本课件旨在帮助读者系统地了解分子生物学的各个方面，包括基本的分子生物学原理、实验技术、研究方法以及应用等。
目录1.第一章：分子生物学概述2.第二章：DNA结构与功能3.第三章：RNA结构与功能4.第四章：蛋白质结构与功能5.第五章：基因表达调控6.第六章：基因突变与遗传变异7.第七章：分子生物学实验技术8.第八章：分子生物学研究方法9.第九章：分子生物学的应用领域第一章：分子生物学概述1.1 什么是分子生物学分子生物学是研究生物体内分子的结构、功能以及相互作用的学科。
它涉及到DNA、RNA、蛋白质等生物分子的研究，以及它们在细胞和生物体中的功能。
1.2 分子生物学的历史与发展分子生物学起源于20世纪50年代，当时发现DNA是物质遗传信息的携带者后，科学家们开始研究DNA的结构和功能，从而奠定了现代分子生物学的基础。
1.3 分子生物学的重要性分子生物学的研究对于了解生命的本质和机理至关重要。
它不仅有助于解释遗传现象，还可以揭示细胞的结构、功能和调控机制，甚至为疾病的诊断和治疗提供理论基础。
2.1 DNA的组成与结构DNA是由基因序列组成的生物分子，它由核苷酸组成。
本节将介绍DNA的基本结构、双螺旋结构和碱基对的配对方式。
2.2 DNA复制与遗传信息传递DNA复制是细胞分裂过程中最重要的事件之一，它确保了遗传信息的传递和稳定性。
本节将介绍DNA复制的过程和机制。
2.3 DNA修复与突变DNA在生物体内容易受到各种外界因素的损伤，因此细胞拥有多种修复机制来修复DNA损伤。
本节将介绍DNA修复的方式和维护基因组稳定性的重要性。
3.1 RNA的种类与功能RNA是DNA转录的产物，它在细胞内发挥着多种功能，包括mRNA的编码信息传递、tRNA的氨基酸运载和rRNA的构建核糖体等。
分子生物学课件(共51张PPT)
蛋白质局部主链的空间结构， 包括α-螺旋、β-折叠等。
三级结构
整条肽链中全部氨基酸残基的 相对空间位置Байду номын сангаас即整条肽链每 一原子的相对空间位置。
四级结构
由两条或两条以上的多肽链组 成的一类结构，每一条多肽链
都有完整的三级结构。
蛋白质的功能与分类
结构蛋白：作为细胞的结构，如膜蛋白，染色体蛋白等 。 酶：催化生物体内的化学反应。
分子生物学是生物学的重要分支
01
分子生物学以生物大分子为研究对象，揭示生命现象的分子基
础，是生物学的重要分支之一。
分子生物学推动生物学的发展
02
分子生物学的发展推动了生物学的研究从细胞水平向分子水平
深入，为生物学的发展提供了新的理论和技术支持。
分子生物学与其他学科的交叉融合
03
分子生物学与遗传学、生物化学、微生物学、免疫学等学科存
。
表观遗传学调控
通过改变染色质结构和DNA 甲基化等方式来调控基因表达
。
05
蛋白质的结构与功能
蛋白质的分子组成
氨基酸
蛋白质的基本组成单元，共有20 种标准氨基酸。
肽键
连接氨基酸之间的主要化学键。
辅基与辅酶
某些蛋白质还包含辅基或辅酶， 以辅助其功能的发挥。
蛋白质的结构层次
一级结构
指蛋白质中氨基酸的排列顺序 。
重组DNA分子的构建和 筛选
PCR技术及其应用
01
02
PCR技术的基本原理和步骤
引物的设计和选择
03
04
PCR反应体系和条件优化
PCR技术在DNA扩增、突变 分析、基因分型等领域的应用
基因克隆与基因工程
分子生物学全套课件(2024)
2024/1/26
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蛋白质在细胞中的作用
蛋白质可以作为酶催化生物体内 的化学反应，维持生命活动的正 常进行。
蛋白质可以作为载体运输物质， 如血红蛋白运输氧气和二氧化碳 。
蛋白质可以作为抗体参与免疫反 应，保护机体免受病原体的侵害 。
蛋白质是细胞结构和功能的基础 ，参与细胞的各种生命活动，如 催化、运输、免疫、调节等。
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基因表达调控的分子机制
DNA结合蛋白的作用
识别并结合特定DNA序列，影响基因转录。
染色质结构与基因表达
染色质结构的变化可影响基因的可及性和转 录活性。
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信号转导与基因表达调控
细胞外信号通过信号转导途径影响基因表达 。
转录后调控机制
包括mRNA剪接、转运、定位和降解等过程 对基因表达的调控。
比较基因组学分析
通过比较不同物种或不同个体之间的基因组差异，揭示物种进化、基 因功能等生物学问题。
生物信息学在基因组学中的应用
利用生物信息学方法对基因组数据进行挖掘和分析，发现新的基因、 突变位点以及与疾病相关的遗传变异等。
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THANK YOU
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DNA的复制与修复
01
02
03
DNA复制的过程
起始、延伸和终止三个阶 段，涉及多种蛋白质和酶 的参与。
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DNA复制的特点
半保留复制、半不连续复 制等。
DNA修复的机制
直接修复、切除修复、重 组修复和SOS修复等，用 于纠正复制过程中产生的 错误。
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DNA的转录与表达
《分子生物学》课件
《分子生物学》课件一、引言分子生物学是生物学的一个重要分支，主要研究生物大分子（如蛋白质、核酸等）的结构、功能、相互作用以及生物信息的传递与调控。
自20世纪50年代以来，分子生物学得到了迅速发展，对生命科学、医学、农业等领域产生了深远影响。
本课件旨在介绍分子生物学的基本概念、研究方法、发展历程和未来展望，以帮助读者更好地理解这门学科。
二、分子生物学的基本概念1.生物大分子：生物大分子是指在生物体内具有重要功能的分子，包括蛋白质、核酸、多糖和脂质等。
这些分子在生物体内通过非共价键相互作用，形成复杂的生物体系。
2.遗传信息：遗传信息是指生物体内传递给后代的信息，主要存在于DNA分子中。
遗传信息的传递与表达是生命活动的基础。
3.基因：基因是生物体内控制遗传特征的基本单位，由DNA序列编码。
基因通过转录和翻译过程，指导蛋白质的合成，从而影响生物体的生长、发育和代谢。
4.转录：转录是指DNA模板指导RNA合成的过程。
在转录过程中，RNA聚合酶酶切DNA双链，合成RNA分子。
5.翻译：翻译是指RNA指导蛋白质合成的过程。
在翻译过程中，tRNA将氨基酸运输到核糖体，根据mRNA上的密码子序列，合成多肽链。
6.信号传导：信号传导是指生物体内信息的传递过程，包括细胞外信号分子、细胞膜受体、细胞内信号转导分子和细胞内靶分子等。
三、分子生物学的研究方法1.克隆技术：克隆技术是指通过体外操作，将DNA片段插入到载体中，并在宿主细胞中复制和表达的过程。
克隆技术是分子生物学研究的重要手段，可用于基因分离、基因功能研究等。
2.基因敲除与基因敲入：基因敲除是指通过基因编辑技术，使特定基因在生物体内失去功能。
基因敲入是指将外源基因导入生物体基因组中，并使其表达。
这两种技术可用于研究基因功能、疾病模型等。
3.蛋白质组学：蛋白质组学是指研究生物体内所有蛋白质的组成、结构、功能及其相互作用的学科。
蛋白质组学技术包括双向凝胶电泳、质谱、酵母双杂交等。
北大生命科学院分子生物学讲分子生物学讲义(朱玉贤)
北大生命科学院分子生物学讲分子生物学课程教学讲义朱玉贤第一讲序论二、现代分子生物学中的主要里程碑分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
当人们意识到同一生物不同世代之间的连续性是由生物体自身所携带的遗传物质所决定的，科学家为揭示这些遗传密码所进行的努力就成为人类征服自然的一部分，而以生物大分子为研究对像的分子生物学就迅速成为现代社会中最具活力的科学。
从 1847年Schleiden和Schwann提出"细胞学说"，证明动、植物都是由细胞组成的到今天，虽然不过短短一百多年时间，我们对生物大分子 --细胞的化学组成却有了深刻的认识。
孟德尔的遗传学规律最先使人们对性状遗传产生了理性认识，而 Morgan的基因学说则进一步将"性状"与"基因"相耦联，成为分子遗传学的奠基石。
Watson和Crick 所提出的脱氧核糖酸双螺旋模型，为充分揭示遗传信息的传递规律铺平了道路。
在蛋白质化学方面，继Sumner在 1936年证实酶是蛋白质之后，Sanger利用纸电泳及层析技术于 1953年首次阐明胰岛素的一级结构，开创了蛋白质序列分析的先河。
而 Kendrew和 Perutz利用 X射线衍射技术解析了肌红蛋白（myoglobin）及血红蛋白（hemoglobin）的三维结构，论证了这些蛋白质在输送分子氧过程中的特殊作用，成为研究生物大分子空间立体构型的先驱。
1910年，德国科学家Kossel 第一个分离了腺嘌呤，胸腺嘧啶和组氨酸。
1959年，美国科学家 Uchoa第一次合成了核糖核酸，实现了将基因内的遗传信息通过 RNA翻译成蛋白质的过程。
同年，Kornberg实现了试管内细菌细胞中 DNA的复制。
1962年，Watson（美）和 Crick（英）因为在 1953年提出 DNA的反向平行双螺旋模型而与 Wilkins共获 Noble生理医学奖，后者通过 X 射线衍射证实了 Watson-Crick模型。
分子生物学第9章课件.ppt
•核糖体结合到mRNA分子的起始序列上，沿着密 码序列读码，方向从5’ →3’，合成的多肽链是 从氨基端到羧基端。 在一个mRNA分子上可以
结合多个不同时间开始翻译的核糖体，称为多聚 核糖体。
•原核的转录与翻译同步时行，真核的转录与翻译
在时空上分开，核糖体游离于细胞质或与内质网
膜结合。
演示课件
翻译过程的基本原理
演示课件
演示课件
演示课件
终止密码子的抑制现象 抑制子tRNA
翻译异常终止 ①“无义”突变 ②非终止mRNA（通过“反式翻译”恢复）
利用终止密码子插入非标准氨基酸
核糖体跳过一大段mRNA后继续翻译，称为翻译 跳跃（translation jumping），其发生位置具有 mRNA的特殊序列结构。
9.3.5 蛋白质合成的调节
1. 真核生物mRNA分子的稳定性 3'-polyA结构、3'非翻译区的AU序列
2. 5'UTR结构与翻译起始的调节 5'帽子结构、起始密码子AUG与上游AUG、AUG侧翼序 列、mRNA前导序列
3. 蛋白质磷酸化对翻译效率的影响 eIF-4E的磷酸化、eIF-2a的磷酸化
演示课件
示多聚核糖体
演示课件
9.3.2 蛋白质生物合成的分子基础
1. 模板——mRNA：作为中间物质传递DNA分子遗 传信息，含三联密码子组成的可读框。
➢ mRNA上的密码子以连续排列方式组成可读框，可读 框外的序列称为非编码区。
➢ 可读框的5’端由起始密码开始，3'端含有1～3个 终止密码。
➢ 原核生物mRNA分子起始密码上游含有核糖体结合位 点序列，分子内多个基因独立地进行可读框翻译； 真核生物mRNA5'端的核糖体进入部位与核糖体结合， 通过一种迅速扫描机制向3’端移动寻找起始密码， 帽子结构对核糖体进入部位的识别起一定作用。
分子生物学讲座
STEP2
完整的另一条母 链DNA与有缺口 的子链DNA进行 重组交换，将母 链DNA上相应的 片段填补子链缺 口处，而母链 DNA出现缺口。
以另一条子链DNA为模板，经 DNA聚合酶催化合成一新DNA 片段填补母链DNA的缺口，最后 由DNA连接酶连接，完成修补。
注意：重组修复不能完全去除损 伤，损伤的DNA段落仍然保留在 亲代DNA链上，只是重组修复后 合成的DNA分子是不带有损伤的， 但经多次复制后，损伤就被“冲 淡”了，在子代细胞中只有一个 细胞是带有损伤DNA的。
转录的过程，涉及到二个方面：
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RNA合成的酶学过程 RNA合成的起始信号和终止信号（特定序列）
单击此处添加小标题
在细胞周期的某一阶段，DNA双链解开成为转录的模板。一切细胞 均具有RNA聚合酶。E.coli细胞中约有RNA聚合酶分子3000个以上。 此酶催化RNA主链中核苷酸间的3'，5'磷酸二酯键的形成。催化反 应速度很快，在37℃时RNA链的延伸可达40个核苷酸/秒。但是这 种催化作用必须有DNA(作为模板)的存在。RNA的合成一定要非常 精确。然而不像DNA那样，转录作用并没有校正（proof-reading） 机制。
点突变(point mutation) 指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤(A与G之间的相互 替代)、嘧啶替代嘧啶(C与T之间的替代)称为转换(transition)；嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤 则称为颠换(transvertion)。
03
缺失(deletion) 指DNA
04 DNA损伤的后果
2、真核生物的RNA聚合酶：
真核生物中已发现有四种RNA聚合酶，分别称为RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和线粒体 （叶绿体）RNA聚合酶，分子量大致都在50万道尔顿左右，它们专一性地转录不同 的基因，因此由它们催化的转录产物也各不相同。
分子生物学讲座(8)
四、限制性核酸内切酶的作用
1、切割方式
大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具 有回文结构特征，切断的双链DNA都产生5’ 磷酸基和3’羟基末端。不同限制性核酸内 切酶识别和切割的特异性不同。
5`…GAATTC…3` 3`…CTTAAG…5`
5`…AAGCTT…3` 3`…TTCGAA…5`
EcoR I
一般认为生物技术包括基因工程、细胞工程、 酶工程和发酵工程几方面的内容。基因工程是生 物技术的核心和关键，是主导技术；细胞技术是 生物技术的基础；酶工程是生物技术的条件；发 酵工程是生物技术获得最终产品的手段，四个方 面相互联系的。生物技术是一个综合技术体系， 其中基因工程和细胞融合技术y gene)是编码能与操纵子序 列结合的调控蛋白的基因。调控方式有负调控 (negative regulation)和正调控(positive regulation)。
某些特定的物质能与调控蛋白结合，使调控蛋 白的空间构像发生变化，从而改变其对基因转录 的影响，这些特定物质中凡能引起诱导发生的分 子称为诱导剂(inducer)，能导致阻遏发生的分子 称为阻遏剂或辅助阻遏剂(corepressor) 。
三、限制性核酸内切酶的分类
按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断 核酸的情况不同，分为三类：
Ⅰ类限制性核酸内切酶：由3种不同亚基构成， 具有修饰酶活性和内切酶活性，它能识别和结合 于特定位点，随机切断识别位点以外的DNA序 列，通常在识别位点周围400-700bp（10005000bp）。这类酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲 硫氨酸及ATP。
谢谢大家！
X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)也是一 种人工化学合成的半乳糖苷，可被β-半乳糖苷 酶水解产生兰色化合物，因此可以用作β-半乳 糖苷酶活性的指示剂。IPTG和X-gal被广泛应 用在基因工程的工作中。
分子生物学教案串讲
分子生物学教案串讲说明：主要是相关的名词解释和课后问题，其它繁杂的知识点请参阅教材与课件。
第一章一、名词解释：1.peptide bond肽键-The carboxyl group of one amino acid can react with the amino groupof another amino acid to form a peptide bond(amide bond-酰胺键).2.肽平面(peptide plane)- 由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子被束缚在同一平面上，这一平面称为肽平面(peptide plane)3.结构域（domain）-是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，相邻的域常被一个或两个多肽片段连结。
4.亚基（subunit）就是指参与构成蛋白质四级结构、每条具有三级结构的多肽链。
5.别构调节Allosteric regulation / --酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后发生构象的改变，进而改变酶活性状态，称为酶的别构调节。
二、问题：1.Character of peptide bond；2. Describing Protein Structure各级结构；3. 蛋白质的二级(Secondary structure)结构的几种形式；4. What physical interactions happen in the process of protein folding? （1） Covalentbonding2）Hydrogenbonding3） Ionic bonding4） Van der Waals forces5） Hydrophobic interaction）第二章一、名词解释：1.Base stacking force碱基堆积力: 每个碱基对平行伸展并且与上面的和下面的碱基对非常靠近，这一现象叫做碱基堆积。
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含有目的基因的DNA模板
对热稳定的DNA聚合酶
一对寡核苷酸引物
4种三磷酸脱氧核苷
保证聚合酶催化反应的缓冲液
（4）人工化学合成 现在计算机控制的全自动核酸合成仪已被广泛 应 用 ， 按 人 们 设 计 好 的 序 列 一 次 合 成 100200bp长的DNA片段已不成问题。但随意合成 的DNA绝大多数肯定不具有生物功能或无法知 道它会有什么功能的，因而只能模仿自然界生 物中已知的基因序列来合成，而化学合成这样 长的基因DNA序列，其价格远高于用PCR法 获得基因，所以目前很少全部用化学方法去合 成基因。但人工设计化学合成核酸片段作为引 物、接头等已经成为分子生物学和基因工程中 必不可少而且十分重要的手段。
第四节 目的基因和载体的连接 将目的基因或序列插入载体，主要靠DNA连 接酶。有以下主要的方式。
一、粘性末端连接
如果目的序列两端有与载体上相同的限制性核 酸内切酶位点，则同一限制酶切开产生的粘末端， 在降低温度退火时，能重新互补结合，在DNA 连接酶催化下，目的序列就与载体DNA链相连 接。
不同的限制性内切酶切，如果产生的DNA的粘 末端相同（同尾酶），也可用此法连接。 如果在连接的两个DNA片段没有能互补的粘性 末端，可用末端核苷酸转移酶催化脱氧单核苷酸 添加DNA的3’末端，例如一股DNA3’端加上polyG， 另一股DNA3’端加上polyC，人工在DNA两端做出 能互补的核苷酸多聚物粘性末端，退火后能连接， 称为同聚物加尾法。 对平末端的DNA，可先连上人工设计合成的脱 氧寡核苷酸双链接头，使DNA末端产生新的限制 内切酶位点，经内切酶割后，即可按粘性末端相 连。
农杆菌示意图
右边界
T-DNA
目的基因
Ti plasmid
左边界
Vir 区
细胞核，示核 仁和核孔
农杆菌附着 在细胞壁上
T-DNA转移的过程示意图
农杆菌转化特点
优点
缺点
单拷贝 插入片段大 表达高效 不需要贵重仪器
基因型依赖 愈伤组织褐化坏死 单子叶不敏感 抑菌比较困难
2、基因组 λ噬菌体整个基因组可分为三个部分： ①左臂：长约20kb，编码构成头部、尾部、尾丝对 组装完整噬菌体所需要的蛋白质。 ②中段：长约20kb，是λDNA整合和切出，溶原生 长所需的序列。 ③右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生 长最重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均 在这区域内。 左右臂是必需的，中段是非必需的 。在中段插入外 源基因不影响它的增殖，这是作为载体的基础。
3、应用 作为载体，但天然不行，需要改造
第三节 目的基因的获取
一般地，基因工程操作可以分为四个步骤
目的基因的获得 目的基因和载体连接
目的基因的转化 目的基因的表达
1、目的基因的概念
符合人们要求的DNA片段，被称为目的基因。
④容易从宿主细胞中分离纯化出来。
⑤有容易被识别筛选的标志。
二、载体的种类 按照性质分：
质粒载体 病毒载体
按照功能分：
克隆载体
表达载体 穿梭载体
常用的载体有质粒，噬菌体和病毒等。 一、质粒载体
质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的， 能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。 其特点如下： ①是染色体外的双链共价闭合环形DNA （covalently closed circuar DNA,cccDNA），可 自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300 kb 之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞ 15kb的大质粒则不易提取。
二、真核细胞
农杆菌转化法
基因枪法
其他方法
1、农杆菌转化
根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 发根农杆菌(A. rhizogenes)
根癌农杆菌浸染
发根农杆菌浸染
根癌农杆菌介导的基本方法 1974年Zaenen等研究发现，根癌农杆菌中存在一个 或几个大的质粒，这些质粒是诱导植物产生肿瘤所 必须的，并称之为Ti质粒（tumour inducing plasmid）。根癌农杆菌的Ti为质粒，发根农杆菌的 为Ri质粒。1977年，用限制性内切酶的方法证实植 物肿瘤组织中存在一段外来的DNA，是整合进植物 染色体的根癌农杆菌Ti质粒的一个片段，称为转移 DNA（transferred DNA），简称T-DNA。当植物 受伤时T-DNA会转入并整合到植物的基因组中，然 后借助植库
从细胞中提取出全部DNA，用物理方法（超声波 等）或酶法（内切酶不完全酶解）将DNA降解成 大小不等的片段，然后将这些片段与适当的载体 连接，转入受体细胞，这样每一个细胞接受了含 有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分 子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个 含有基因组各DNNA序列。
基因组DNA酶切（2）cDNA提出细胞的全部 mRNA，在体外反转录成 cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体） 连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA， 并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信 息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文 库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只 有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同 分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不 尽相同，所以cDNA具有组织细胞特异性。5` 3`
GGGGG CCCCC
3` 5`
同聚物加尾法
二、平末端连接
T4 DNA连接酶能催化DNA平末端的连 接。如果目的序列和载体上没有相同的 限制性内切酶位点可供利用，用不同的 限制性内切酶切割后的粘性末端不能互 补结合，则可用适当的酶将DNA突出的 末端削平或补齐成平末端，再用T4 DNA 连接酶连接，但平末端连接要比粘性末 端连接的效率低得多。
第五节
目的基因导入细胞
目的基因序列与载体连接后，要导入细 胞中才能繁殖扩增，再经过筛选，才能 获得重组DNA分子克隆，不同的载体在 不同的宿主细胞中繁殖，导入细胞的方 法也不相同。
一、原核细胞
1、热激和电激
由于外源DNA的进入而使细胞遗传特性改变称 为转化。1943年Avery等就发现肺炎双球菌转化 现象。 DNA自然进入细胞的效率很低，在基因工程中 可采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容 易接受外界DNA，称为感受态细胞，再与外源 DNA接触，就能提高转化效率。例如大肠杆菌 经冰冷CaCl2的处理，就成为感受态细菌，当加 入重组质粒并突然由4℃转入42℃作短时间处理， 质粒DNA就能进入细菌；用高电压脉冲短暂作 用于细菌也能显著提高转化效率容易从中筛选克隆得细胞特异表达 的DNA。
（3）聚合酶链式反应（PCR） 如果已经知道目的基因的序列，就能很方便地 用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR），从基因组DNA或cDNA中②能自主复制，是能独立复制的复制子。按质 粒复制的调控及其拷贝数可分两类：
严紧控制（stringent control）型：复制常与 宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞只有 一个到十几个拷贝；
松弛控制（relaxed control）型：复制和宿主 不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。
③质粒对宿主生存并不是必需的。
一、根据重组载体的标志作筛选
最常见的载体携带的标志是抗药性标志， 如抗氨芐青霉素（amp-r）、抗四环素(ter-r)、 抗卡那霉素(kan-r)等。当培养基中含有抗生 素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞 才能生存繁殖，这就把凡未能接受载体DNA 的细胞全部筛除掉了。
第二节 基因工程载体
一、作为载体的条件： 分离的基因自身不能繁殖，需要载体携 带它们到合适的细胞中复制和表现功能。 对理想的基因工程载体一般至少有以下几 点要求。
①能在宿主细胞中复制，而且最好要有较
高的复制能力。
②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高
越好。
③容易插入外来核酸片段，插入后不影响
其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要 求载体上要有合适的酶切位点。
2、感染 噬菌体进入宿主细菌，病毒进入宿主细胞中繁殖 就是感染（infection）。用经人工改造的噬菌体 活病毒作载体，以其DNA与目的序列重组后，在 体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA包装 成有活力的噬菌体或病毒，就能以感染的方式进 入宿主细菌或细胞，使目的序列得以复制繁殖。 3、转染 重组的噬菌体DNA也可象质粒DNA的方式进入 宿主菌，即宿主菌先经过CaCl2，电穿孔等处理 成感受态细菌再接受DNA，进入感受态细菌的噬 菌体DNA可以同样复制和繁殖，这种方式称为转 染。
2、基因枪法
PDS 1000/He
基因枪原理
手持式基因枪
基因枪转化特点
优点
缺点 费用高 基因沉默
操作简单
快速高效
处理样品多
不依赖基因型
多拷贝
3、其他方法
花粉管通道法
原生质体转化
超声波法、 电激法、 激光转化法等
第六节 含目的基因克隆的筛选与鉴定
目的序列与载体DNA正确连接的效率、重组导 入细胞的效率都不是百分之百的，因而最后生长 繁殖出来的细胞并不同都带有目的序列。一般一 个载体只携带某一段外源DNA，一个细胞只接 受一个重组DNA分子。最后培养出来的细胞群 中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的 序列的重组体（recombinant）。将目的重组体 筛选出来就等于获得了目的序列的克隆，所以筛 选是基因克隆的重要步骤。在构建载体，选择宿 主细胞、设计分子克隆方案时都必须仔细考虑筛 选的问题。