普洱茶中黄酮类化合物含量的测定方法

普洱茶中黄酮类化合物含量的测定方法
王丽;邵金良;魏茂琼;林涛;刘兴勇;汪禄祥;梅文泉;刘宏程
【摘要】为了解不同加工工艺和储存年限的普洱茶中黄酮类化合物的含量,建立了同时测定普洱茶中芦丁、金丝桃苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、芹菜素、山奈酚6种黄酮类化合物含量的高效液相色谱检测方法。

样品经体积分数为80%甲醇水溶液涡旋超声提取、离心后,高效液相色谱法测定,采用Waters C18柱(4.6 mm×250.0 mm,5μm),以乙腈-0.5%冰乙酸(18：82,体积比)的溶液为初始流动相,梯度洗脱,流速1.2 ml/min,检测波长为354 nm。

结果显示,在最优的检测条件下,各目标化合物的加标回收率为76.26%~108.96%,相对标准偏差均不大于7.18%,6种黄酮类化合物的检出限为0.010~0.040 mg/kg,定量限为0.03~0.10 mg/kg。

普洱茶实际样品分析结果表明：不同加工工艺和储存年限的普洱茶中6种黄酮类化合物含量有显著或极显著差异,6种黄酮类化合物含量可作为普洱茶加工工艺及储存年限判别的一个评价指标。

%A method was developed for the simultaneous determination of rutin, hyperoside, kaempferol-3-O-ruti-nosid, quercetin, apigenin and kaempferol in pu-erh tea by high performance liquid chromatography ( HPLC) equipped with UV detector to understand the content of flavonoids with different processing techniques and storage period. The ana-lytes were extracted from the pu-erh tea samples by 80% methanol with ultrasonic assistance and analyzed by high perform-ance liquid chromatography. The separation was conducted by
C18 column (4. 6 mmí250. 0 mm, 5 μm) with gradient elu-tion. The mobile phase consisted of acetonitrile-glacial acetic acid, and the initial composition of mobile phase started at 18 : 82 ( V/V) with flow rate of 1. 2
ml/min and wavelength of 354 nm. The results revealed that the recoveries of standard ad-dition were 76. 26%-108. 96%, and the relative standard devia-tions( RSDs) were all no more than 7. 18%. The limits of detec-tion were 0. 010-0. 040 mg/kg, and the limits of quantification were 0. 03-0. 10 mg/kg for six flavonoids, respectively. The content of six flavonoids in pu-erh tea with different processing techniques and storage period has significant or extremely signifi-cant differnce, which can be used as an indicator for the identifi-cation of storage period and processing techniques of pu-erh tea products.
【期刊名称】《江苏农业学报》
【年(卷),期】2016(032)006
【总页数】6页(P1410-1415)
【关键词】普洱茶;黄酮类化合物;高效液相色谱
【作者】王丽;邵金良;魏茂琼;林涛;刘兴勇;汪禄祥;梅文泉;刘宏程
【作者单位】云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南昆明 650223; 农业部农产品质量监督检验测试中心昆明，云南昆明 650223;云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南昆明 650223; 农业部农产品质量监督检验测试中心昆明，云南昆明 650223;云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南昆明 650223; 农业部农产品质量安全风险评估实验室昆明，云南昆明650223;云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南昆明 650223; 农业部农产品质量安全风险评估实验室昆明，云南昆明 650223;云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南昆明 650223; 农业部农产品质量监督检验测试中
心昆明，云南昆明 650223;云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南昆明 650223; 农业部农产品质量监督检验测试中心昆明，云南昆明 650223;云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南昆明 650223; 农业部农产品质量监督检验测试中心昆明，云南昆明 650223;云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南昆明 650223; 农业部农产品质量安全风险评估实验室昆明，云南昆明 650223
【正文语种】中文
【中图分类】TS272.5+4
普洱茶是以云南西双版纳、思茅等地大叶种晒青毛茶为原料，经揉捻、杀青及固态发酵等过程加工而成的散茶和紧压茶，属于地理标示农产品[1]。

因其浓厚的文化底蕴且具有“三降”、减肥、消食化痰、清胃生津、醒酒解毒等多种特殊保健功效，被公认为绿色健康饮品，深受消费者的青睐并享誉海内外[2-6]。

研究结果表明，普洱茶富含的黄酮类化合物，是普洱茶药理作用的主要活性成分之一，具有防癌抗癌、抗心血管疾病、抗骨质疏松、消除自由基和抗氧化等功能[7-14]。

芦丁、槲皮素及山奈酚等是普洱茶中具代表性的黄酮类物质[15]。

普洱茶属发酵茶，不同的加工工艺及不同的贮存年份对普洱茶中黄酮类物质含量有一定影响[16]。

目前茶叶中黄酮类物质分析多采用亚硝酸钠-硝酸铝法和三氯化铝法，并以槲皮素或者芦丁为标准品进行比色测定[15，17]，但这些方法只能测得茶叶中总黄酮的含量，不能反映各种黄酮组分的情况。

高效液相色谱法(HPLC)可用于单一黄酮化合物的测定，并能进行有效分离，同时具有易操作、稳定性好和灵敏度高等优点，更适合于普洱茶中黄酮类化合物的分析测定。

本研究旨在建立一种基于高效液相色谱法(HPLC)的方法，同时快速测定普洱茶中6种黄酮成分含量，为普洱茶的黄酮类物质组成的进一步研究及质量控制标准的制
定提供科学理论依据。

同时对不同储存年份、不同加工方式生产的生熟普洱茶中黄酮化合物含量进行对比研究，为普洱茶的储存年份及加工工艺的辨别，提供理论依据。

1.1 材料与试剂
普洱茶样品：供试的普洱茶样品均购自昆明市茶叶市场，并存放在相同环境条件下进行储藏。

对照品：芦丁、金丝桃苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、芹菜素、山奈酚(百
灵威公司产品)，纯度≥98.0%，乙腈、甲醇：HPLC级(德国Merck公司产品)，
磷酸、冰乙酸：分析纯(国药集团化学试剂有限公司产品)。

1.2 仪器与设备
高效液相色谱仪：Waters Alliance e2695型，美国Waters公司产品；二极管阵
列检测器：2998型，美国Waters公司产品；涡旋混匀器：QL-861型，海门市
其林贝尔仪器有限公司产品；超声波清洗仪：KQ-500DB型，昆山市超声仪器有
限公司产品；高速离心机：TGL-10B-6D型，上海安亭科学仪器厂产品。

1.3 试验方法
1.3.1 对照品溶液的配制分别精确称取芦丁、金丝桃苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、
槲皮素、芹菜素、山奈酚对照品各5 mg，置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成500 mg/L的对照品储备溶液，避光低温保存备用。

并用甲醇逐级稀释，配制成质量浓度分别为50.0 mg/L、20.0 mg/L、10.0 mg/L、5.0 mg/L、2.0 mg/L、1.0 mg/L、0.5 mg/L的系列标准工作溶液。

1.3.2 液相色谱条件色谱柱：Waters C18 柱(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.5%(体积比)冰乙酸水溶液(B)。

梯度洗脱条件为：0～9.5 min，18% 乙腈；9.5～1
2.0 min，35% 乙腈；12.0～22.0 min，35% 乙腈；22.0 min后回到初始状态18% 乙腈。

流速：1.20 ml/min，柱温：30.0 ℃，进样体积：10.0 μl，
紫外检测波长：354 nm。

1.3.3 样品处理样品粉碎过40目筛，准确称取样品0.5 g，置于50 ml离心管中，加入不同体积分数及不同用量的甲醇水溶液，剧烈振摇混匀，高速涡旋1 min后，分别经振荡浸提法和超声浸提法提取40 min，以5 000 r/min 离心5 min，移取离心上清液1 ml经0.22 μm有机相滤膜过滤，待上机测定。

甲醇体积分数设为50%、60%、70%、80%、90%，用量设为5 ml、10 ml、15 ml、20 ml、25 ml。

2.1 色谱条件的优化
2.1.1 流动相和流速的优化黄酮类化合物因其分子中具有酚羟基和γ-吡喃环上1-
位氧原子上有未共用电子对，故显弱酸性[18] ，所以流动相内要加入适量的酸。

本试验考察了以甲醇、乙腈与多组不同浓度酸性水溶液作为流动相时6种黄酮的
分离情况，同时比较了磷酸和冰乙酸对分离效果的影响。

结果(图1)显示，在冰乙
酸条件下6种黄酮类化合物的物质响应值略高于磷酸条件下，最终从分离效果角
度考虑，确定乙腈-0.5%冰乙酸水溶液作为流动相。

同时比较了不同流速(0.80
ml/min、1.00 ml/min和1.20 ml/min)条件对目标物出峰时间和峰形的影响，结果表明，流速为1.20 ml/min时分离效果好且峰形较好。

2.1.2 检测波长的确定本试验利用二极管阵列检测器在190～500 nm波长条件下对芦丁、金丝桃苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、芹菜素、山奈酚6种化合物标准溶液进行最大吸收光谱扫描，获得各物质的最大吸收波长分别为：354 nm、354 nm、347 nm、364 nm、337 nm、364 nm。

为保证各组分均能得到较好
灵敏度，确定最佳检测波长为354 nm。

2.2 提取条件优化
2.2.1 提取溶剂的选择黄酮类化合物为极性化合物，在极性溶剂中具有较大的溶解度。

本试验对不同体积分数甲醇(50%、60%、70%、80%、90%)及用量(5 ml、
10 ml、15 ml、20 ml、25 ml)进行优化。

结果表明，以体积分数80%甲醇溶液
作为提取溶剂时提取效率最高(图1)。

0.5 g样品加入10 ml 提取溶剂时，黄酮提
取效率最高(图2)。

2.2.2 提取方法的选择对普洱茶黄酮的提取方法考察了振荡浸取法和超声波浸取法。

结果表明，超声波浸取法提取效率相对更高，同时对超声时间进行优化，从图3
可以看出40 min时目标物的提取达到相对平衡，最终选择超声波浸取法，提取时间为40 min。

2.3 方法学评价
2.3.1 线性范围与检出限在最佳测定条件下， 6种黄酮类化合物在0.5～50.0
mg/L线性关系良好，相关系数(r)大于0.999 5(表1)。

将混合对照品储备液逐步稀释，并以3倍信噪比估算检出限(LOD) 和10倍信噪比估算定量限(LOQ)，各类黄酮类化合物的检出限为 0.010～0.040 mg/kg，定量限为0.03～0.10 mg/kg(表1)。

2.3.2 回收率和精密度称取同一份已知黄酮含量的茶叶样品，根据样品中黄酮实
际含量选择低、中、高3个浓度标准溶液进行定量添加，并按照方法1.3.3 中的方法进行前处理和按照方法1.3.2的色谱条件进行测定，计算各自的回收率和RSD 值，结果见表2，可知5 mg/kg、10 mg/kg和50 mg/kg 3个添加水平的平均
回收率为76.26%～108.96%(每个添加浓度平行测定6次)，相对标准偏差(RSD)
均不大于7.18% 。

2.3.3 稳定性试验将浓度为1.00 mg/L 的6种混合对照品溶液在1 d内间隔2 h
重复测定5次，同时在5 d内每天重复进样测定，通过计算每种黄酮峰面积的相
对标准偏差(RSD)来分析对照标准溶液的稳定性。

结果表明，6 种黄酮类化合物的日内精度和日间精密度分别为1.53%～3.22%和1.97%～4.06%，表明所建立方
法对6种黄酮类化合物可实现稳定检测。

2.3.4 重复性试验称取同一份普洱茶样品5份，按方法1.3.3中的方法平行制备5份样品溶液，进行测定，计算RSD值以考察方法的重复性。

结果表明，样品中芦丁、金丝桃苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、芹菜素、山奈酚的RSD为
3.16%～
4.95%，说明该方法具有良好的重复性。

2.3.5 普洱茶样品测定按上述前处理和色谱条件对2011年生普洱茶(6个)、2011年熟普洱茶(6个)、2015年生普洱茶(6个)、2015年熟普洱茶(6个)中黄酮类化合物进行检测，每个样品重复测定2次，结果见表3，色谱图见图4、图5。

从表3可知，生普洱茶和熟普洱茶中6种黄酮类化合物含量差异显著，相同储存年份普洱茶总黄酮含量生茶显著大于熟茶。

熟茶中6种黄酮类化合物均有检出，含量差异很大，芦丁含量最高(756.63～894.29 mg/kg)，芹菜素含量相对偏低。

生茶中除芹菜素没有检出，其他5种黄酮类化合物均检出，芦丁含量最高(2 174.81～2 193.21 mg/kg)，山奈酚-3-O-芸香糖苷次之。

对于单一黄酮，相同储存年份的生普洱茶中芦丁、金丝桃苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷含量极显著高于熟普洱茶，而熟普洱茶中槲皮素、芹菜素和山奈酚含量极显著高于生普洱茶。

对不同储存年份普洱茶中总黄酮含量进行对比， 2011和2015两个年份生普洱茶总黄酮含量差异不显著，但熟普洱茶总黄酮含量差异极显著。

单一黄酮含量比较，2015年熟普洱茶中芦丁、金丝桃苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷3种黄酮含量极显著高于2011年熟普洱茶，而槲皮素、芹菜素和山奈酚含量极显著低于2011年熟普洱茶，2015年生普洱茶中芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷含量极显著高于2011年生普洱茶，而金丝桃苷、槲皮素和山奈酚含量极显著低于2011年生普洱茶。

本研究利用高效液相色谱，建立了同时、快速检测云南省不同储存年份生熟普洱茶样品中芦丁、金丝桃苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、芹菜素和山奈酚6种黄酮成分的方法。

该方法的回收率及精密度均满足测定要求，可用于普洱茶样品中黄酮类化合物的快速检测。

相较于茶叶总黄酮测定方法，本方法可以更加准确分析单
一黄酮组分的含量。

普洱茶在加工和自然存放过程中，由于微生物的参与，茶叶内成分会发生一系列的复杂变化和转换。

本试验结果显示，普洱茶中含有丰富的黄酮类化合物，不同加工工艺和储存年限的普洱茶中各种黄酮成分的含量有一定差异，可作为普洱茶加工工艺生茶、熟茶及储存年限判别的一个评价指标。

由于茶叶本身基质复杂，要更加准确确定各黄酮类化合物需进一步借助质谱技术的使用。

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