使用过程中

使用过程中
1.保留时间重现性不好。

保留时间不重现还会影响到峰面积的重现性，导致实验无法进行。

引起这种现象
因素很多，建议检查以下几个方面：
-确认流动相是新鲜配置的，比例没有错误。

流动相中易挥发成分挥发及循环使用流动相造成流动相组成变化影响了保留时间。

-温度的影响。

有些样品或流动相对温度敏感，可增加恒温装置保持柱温恒定或增加空调系统保持室温恒定。

-确认色谱柱是好的。

-检查一下溶剂瓶里的溶剂过滤器没有长菌，没有被堵塞。

-如果您使用梯度洗脱方法，请确认平衡时间足够长。

-仔细观察柱前压得变化，如果压力稳定，就可以判断泵的系统没有问题，请换新的色谱柱试试。

-如果是压力不稳定，一定会影响保留时间。

解决方法请参见第2条
2.柱压不稳定
⑴引起这种故障最常见的原因是溶剂或泵里有气泡，建议用以下的方法排除。

对溶剂脱气处理，检查脱气机是否打开，排气泡清除泵内空气。

⑵泵密封垫损坏，更换密封垫即可。

⑶主动阀阀芯污染。

可以将阀芯取下，用甲醇超声清洗。

⑷系统漏液使压力陡降，找出漏点密封即可。

⑸可能是溶剂或样品中含有颗粒杂质将筛板堵塞使柱压升高，可过滤
溶剂、更换柱入口筛板、柱前接在线过滤器等来处理。

⑹管路堵塞，清洗管路。

⑺如果是排气阀里的过滤芯堵塞引起的压力升高，请仔细检查一下换
下来的过滤
芯。

-如果过滤芯的颜色发黑，说明是被柱塞密封垫磨损下来的碎屑堵塞的，请确
认流动相使用的缓冲盐的浓度是否太高了，是否使用了柱塞清洗装置。

缓冲液在泵头内部析出的盐的结晶会加速密封垫的磨损。

-如果过滤芯的颜色是乳白色的，非常干净。

说明过滤芯很有可能是
被流动相
污染了。

请检查一下您是否使用了过期的溶剂（水，有机溶剂），或
质量不好的溶剂。

如果流动相经过了滤膜过滤，请确认是否使用了正确的、优质的滤膜。

-如果存放缓冲液或水的溶剂瓶不经常清洗，该通路会生长藻类，藻
类会污染
整个流路系统和脱气机的腔体，藻类及其代谢产物也会堵塞过滤芯。

如果发生了这种情况，建议用60度的热水清洗溶剂瓶，并用异丙醇清洗
整个管路和脱气机。

建议以后一定要用棕色瓶存放缓冲溶液，避光，并且
定期清洗溶剂瓶。

3.峰面积或峰高重现性不好，偏差大
如果HPLC系统配有自动进样器，这种情况主要是自动进样器的问题。

-首先确认柱前压是稳定的，保留时间的重现性好（参见第1，2条）- 将自动进样器的抽样速度降低到 50ul/min 以下。

您的样品有可能
粘度较大，降低抽样速度可以极大地改善粘度较大的样品的进样精度。

-如果进样针或针座有轻微的堵塞，对进样精度的影响也非常大。

4.基线漂移，如何处理？
-柱温波动，控制柱温和室温。

-流动相不均匀或平衡不够，使用高纯度试剂配制流动相，并脱气，
进样前充分平衡。

-流通池被污染或有气体，用甲醇或其他强极性溶剂(不能用盐酸)冲
洗流通池。

-样品中有强保留的物质被洗出从而表现出一个逐步升高的基线。

改
变分析条件，如有必要，在分析过程中定期用溶剂清洗柱子。

5.紫外检测器（DAD，VWD）信号波动大，噪音大，如何处理？
引起这种问题的因素很多，要一步一步排除，直到找到问题真正原因。

-确定柱前压稳定；溶剂（高纯度的有机溶剂、水）使用正确，流动
相脱气良
好（请参考第2条）。

-检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出或不正常的噪音，如有必要更换泵密封。

-检查检测器的氘灯是否已经到了使用寿命，是否更换过新的氘灯。

-用异丙醇清洗整个系统，更换过滤芯，排除污染源。

-清洗流动池和有关的透镜（需要工程师去现场服务）
6.HPLC出“鬼峰”，如何排除？
HPLC出“鬼峰”大部分发生在反相体系（甲醇，乙腈，水），是溶剂被污染
造成的。

还有一种原因是进样系统有残留。

- 让用户运行一个空白梯度洗脱的方法，从 100%水过渡到 100%有机溶剂，如果“鬼峰”出现，可以判断是水被污染了（水中有藻类 Algae 的污染）。

如果用户是使用纯水机制作的水，这种现象是最常见的。

建议用户更换“娃哈哈” 纯
净水。

- 进样系统有残留很容易判断，建议用户加强或改善洗针程序，延长冲洗 Loop
的时间。

7.HPLC出“拖尾峰”，如何排除？
⑴筛板阻塞：柱子两头的过滤筛板如果堵塞，样品就会在筛板部分受
阻而形成时间延迟，使得样品在柱后流出时峰型形成拖尾。

需要通过反冲
色谱柱，或者更换筛板。

⑵色谱柱塌陷：是指色谱柱由于其它原因引起了柱效率丧失，不能对
物质形成保留，使得物质不在固定相上保留而随流动相流出，但是又还有
一点柱效，因此形成拖尾。

需要重新填充色谱柱或者更换色谱柱。

⑶有污染：即样品不在同一起跑线起跑，从后面开始跑得到达终点稍晚，表现出拖尾。

更换色谱柱或者采用有机溶剂梯度洗脱1h以上，以冲
洗柱子。

⑷流动相PH值选择错误：如某PH下有的样品存在分子型和离子型的
动态平衡，离子型的陆续向分子型转化就会表现出拖尾。

调节PH值可抑
制分子解离，改善拖尾，对于碱性化合物，相对较低的PH值更有利于得
到对称峰。

8.HPLC出“前沿峰”，如何排除？
⑴样品过载：被保留的样品在正常出峰时间前陆续出来，形成前沿峰。

降低样品含量。

⑵样品溶剂选择不恰当：当样品溶剂的洗脱能力大大强于流动相时会
出现前沿峰，例如，在反相色谱中用已腈做样品溶剂，而流动相的洗脱力
较弱时会出现前沿峰。

选择流动相或者接近流动相的比例作为样品溶剂。

⑶色谱柱损坏：色谱柱柱效损失，不能对物质形成保留。

更换色谱柱。

⑷在大峰前有小峰出现，假象前沿峰，即大峰前包埋了没有分开的小峰。

调整流动相洗脱梯度。