利用生物工程法制备重组胰岛素

串联BKRA基因的构建
• 为进行，合成了彼此互补的两个片段：
• 然F后7：将CTG磷GA酸G A化AC的TAFC 7TG与T A等AC摩CG尔T C的GC F正8向退链 火，中间 F8：AAT TGC GAC GGT TAC AGT AGT TCT CCA G 反向链
5’ -CTG GAG AAC TAC TGT AAC CGT CGC-
GTC ACA
TGC终A止CC TCC ATC TGC TCC CTT TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGT
人胰岛素原类似物BKRA基因的克隆
• 分别以EcoRⅠ- HindⅢ双酶切pUC18 DNA和上述构
建的BKRA基因片段（182bp），将载体DNA与BKRA 片段（171bp）连接，获得重组质粒pUCⅠ。分别经 EcoRⅠ-HindⅢ双酶切和PvuⅡ不完全酶切鉴定，均产 生了与 其大小的DNA片段。
GGC TTC
小C肽
GAG CAT CTT CGA GAC ATG GAC CAA ACG CCA CTT GCA
CCG AAG
Lys Arg
PvuII F7F8接头
TTT TAC ACT CCG AAA ACT AAG CGC GGT ATC GTT GAA
CAG TGT
AAA ATG TGA GE*GC TTT TGA TTC GCG CCA TAG CAA CTT
串联BKRA基因的构建
• 为了正确连接两个BKRA基因，在此设计了一个
连接头接在前一个BKRA基因的末端，并构建了 一个能与下一个BKRA基因5’端EcoRI粘端互补 的序列。
• 然而由于接头是在PvuII平末端与前一个BKRA
基因连接的，因此会切掉部分胰岛素A链基因， 所以接头要补上相应的部分。
重组后BKRA片段基因结构
EcoRI
GGG AAT TCT ATG TTC GTT AAC CAG CAC CTG TGT GGC TCT CAC
CCC TTA AGAMTAC AAG CAA TTG GTC GTG GAC ACA CCG AGA CTG
CTC GTA GAA GCT CTG TAC CTG GTT TGC GGT GAA CGT
P
E
H
pUCI EcoRI
2806bp HindⅢ
P
E
H
pUCI EcoRI
2806bp PvuII
E* P
P E* P
P pKK223-3 H
P
pKIL
PHvuII不完全 E pUC2I H
4584bp PvuII+HindIII 2797bp
HindⅢ
2980bp
P
E*
EH
pUC18 EcoRI 2886bp HindⅢ
E
H
B
pET28a(+) 5369bp
E*
P
P
E pUC2I H (E`) 2980bp
EcoRI
MungBean
HindIII
H E` B E`
+
H
E` B
H
连接
pET2I 5691bp
串联BKRA融合蛋白的表达和纯化
• 在IPTG诱导下，pET2I转化菌的表达产物为氨基酸末
端含有六组氨基酸肽段的融合蛋白，其一级结构可简 单表示为：
融合蛋白的后处理
• 用溴化氰裂解该融合蛋白，再经胰蛋白酶
处理，断开碱性氨基酸Arg和Lys的羧基端， 然而会误切掉B肽末端8个或1个氨基酸， 然后再进行连接通过胰酶转肽的方法，接 上相应 片段的肽链，最终获得人胰岛素。
三联体BKRA
• 在串联的BKRA基础上再连接一个BKRA
这样可以增强表达效率，这与Shen发现 的随着串联分子数增加，表达水平升高 的结果相一致，如图：
• 用EcoRI-PvuII双酶切pUCI DNA，回收150bp
片段
• 用PvuII-HindIII双酶切pKIL DNA 获得195片段 • 共连接pUC18 DNA EcoRI-HindIII载体片段与
上述150bp、195bp片段，获得含有串联 BKRA基因(345bp)的重组质粒pUC2I。
182bp。
BKRA片段基因结构
EcoRI
B肽
F1 GGG AAT TCT ATG TTC GTT AAC CAG CAC CTG TGT GGC
TCT CAC
CCC TTA AGAMTAC AGA CTG
AAG
CFA3A
TTG
GTC
GTG
G AFC2
ACA
CCG
CTC GTA GAA GCT CTG TAC CTG GTT TGC GGT GAA CGT
GGC TTC
小C肽
A肽
F5
GAG CAT CTT CGA GAC ATG GAC CAA ACG CCA CTT GCA
CCG AAG F4
KR
PvuII
TTT TAC ACT CCG AAA ACT AAG CGC GGT ATC GTT GAA
CAG TGT AHAinAdIAITIG TGA GGC TFT6T TGA TTC GCG CCA TAG CAA CTT
• 分别经EcoRI-HindIII双酶切和PvuII不完全酶
切鉴定，均产生了与其大小的DNA片段。
核苷酸序列分析
• 将EcoRI-HindIII双酶切pUC2IDNA获得的串联
BKRA基因片段(345bp)克隆于M13mp18获得重 组噬菌体，按常规方法制备单链重组DNA。 DNA序列分析表明，BKRA基因序列与预期的相 符合，串联BKRA 基因接头连接正确
利用生物工程法制备重 组胰岛素
2021年7月12日星期一
1、胰岛素的结构
1. 胰岛素是一条多肽，分子质量5734，由51个氨基
含有A、B两条链，A链由21个氨基酸组成，B链 酸组成，它们之间有两条二硫键A7-B6、A20-B 链自身在6
与11位有第三条二硫键
2.用基因工程方法生产人胰岛 • 一种是胰岛素原途径，即途基径因工程所生产的
3’
-GAC CTC TTG ATG ACA TTG GCA GCG TTA A-
PvuII
EcoRI
位点
位点
接头基因 对比
串联BKRA基因的克隆
• 其5’端为PvuⅡ平端，3’端含有与EcoⅠ粘端互补的
接后不能再被EcoRI切割。然后共连接pKK223-3 PvuⅡ-HindⅢ双酶切较大片段(2602bp)和BKRA基 (171bp)与上述接头，获得BKRA基因5’端带有接头 pKIL
GTC ACA
返回
TNGC RACCR TCCN ATSC TMGC TCC CTT TAC CAG CTG粒的构建
• 以EcoRI完全酶切表达载体pET-28a(+)，用
MungBean核酸酶切平末端，再经HindIII完全酶切， 同回收载体片段；取pUC2I，同上完成EcoRI、 Mungbean核酸酶和HindIII处理，同回收345bp串联 BKRA基因片段，将pET-28a(+)重组表达质粒pET2I。 经BamHI-HindIII双酶切，产生了预期的347bp片段； 而经EcoRI-HindIII双切酶未产生任何插入片段，表明 EcoRI位点消失。
• MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSAM BKRAR
RNSMBKRA
• 该蛋白全长147个氨基酸，推测分子量约为16.5kD，
以包含体形式存在于细菌中。经SDS-PAGE分析，表 明表达的融合蛋白的大小与预期的相符合。取表达菌 经超声波裂解获得包含体，以PBSU溶液（20mmol/L 磷酸盐缓冲液，PH7.4，0.5mol/LNaCl，8mol/L尿素） 溶解包含体后，进行纯化。
或是其类似物，然后将胰岛素原或者其类似 为胰岛素。
• 另一种是A，B链重组途径，即用基因工程方法分别
A，B链，纯化的A，B链再经重组产生胰岛素。
人胰岛素原类似物BKRA基因的合成
• 将BKRA基因分成6个片段合成，其中F1、F3、F5片
F2、F4、F6片段为反向链（Fig.1）。将各基因片 数混合、退火：以Klenow片段完成中间补链和末端 含有限制性酶切位点的BKRA基因片段，全长