去甲斑蝥素对裸鼠原位胰腺癌血管生长的影响

去甲斑蝥素对裸鼠原位胰腺癌血管生长的影响
发表时间：2017-06-02T09:56:06.843Z 来源：《中医杂志》2016年12月作者：宋冰张文婧郭仁德谷川[导读] 去甲斑蝥素（NCTD）具有抗癌活性强、靶点众多、毒副作用小的特点，临床主要用于治疗肺癌、食管癌及胃癌等。

(天津市第一中心医院普外科天津 300192) 【摘要】目的：研究去甲斑蝥素（NCTD）对裸鼠原位胰腺癌血管生长的影响。

方法：胰腺癌细胞（Capan-2）培养转代后注射到裸鼠胰尾部被膜下建立移植瘤模型，40只胰腺癌（Capan-2细胞）移植瘤裸鼠，随机分成对照（NS）组20只和实验（NCTD）组20只。

对照组0.9%生理盐水腹腔注射0.4mL（每3天一次，共7次）；实验组 NCTD?20mg/kg 腹腔注射（每3天一次，共7次）。

末次给药后第7天，检测肿瘤血供情况。

结果：与对照组相比，经NCTD干预的裸鼠生长状态基本不受影响，但瘤体生长受到抑制，瘤内血流峰值（PI）明显下降，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。

结论：去甲斑蝥素能明显抑制胰腺癌的血管生成，具有明确抗胰腺癌作用。

【关键词】去甲斑蝥素；胰腺癌
去甲斑蝥素（NCTD）具有抗癌活性强、靶点众多、毒副作用小的特点，临床主要用于治疗肺癌、食管癌及胃癌等，但其对于同属消化系统的胰腺癌是否具有抗癌作用尚不明确。

本实验旨在探讨NCTD对裸鼠原位胰腺癌血管的作用，为胰腺癌癌的治疗提供新的治疗思路和实验基础。

1 材料与方法
1.1 材料
NCTD购自南京泽朗医药科技公司（纯度＞99％）；胰腺癌细胞株（Capan-2）购自中国科学院上海细胞库；BALB/cnu/nu裸小鼠４０只，购自上海肿瘤研究所实验动物部，雄性，鼠龄6～8周，体质量20g左右，在SPF级条件下饲养。

RPMI‐1640培养液和胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司；兔抗VE‐Cd单克隆抗体购自Abcam公司，兔抗VEGF 、HIF-lα、CD34多克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多克隆抗体购自R&D公司。

Ｂ超仪使用具有超声造影程序的Simens$2000超声诊断仪。

1.2方法
1.2.1细胞的培养和传代
胰腺癌Capan-2细胞采用贴壁培养的方法，养于37℃含5％C02的培养箱中。

使用添加有10％胎牛血清并100 U／ml青霉素和100 U／ml链霉素的RPMIl640培养基进行细胞培养，长至80％、90％细胞时传代。

取对数生长期的细胞用于实验研究。

1.2.2动物模型建立、分组及给药方法
2％戊巴比妥钠(50mg／Kg)腹腔注射麻醉裸鼠，取左上腹直肌旁lcm切口，暴露脾脏和胰腺尾部，用50u L微量注射器吸取50u L胰腺癌细胞悬液，在放大镜下注射到脾脏下面的胰尾部被膜下，以被膜下出现可鉴别的隆起性液泡而无液体渗漏到腹腔为注射成功的标志。

注射成功后分两层关闭腹壁，共制备40只裸鼠。

4周后如可在裸鼠左上腹触及一结节，即为模型建立成功。

40只裸鼠均造模成功。

鼠称重后随机分为2组：对照（生理盐水）组(NS)、去甲斑蝥素组(NCTD),每组20只。

分组当天开始腹腔注射给药，对照组 0.9%生理盐水腹腔注射
0.4mL；实验组 NCTD?20mg/kg 腹腔注射,均每3天一次，共7次。

1.2.3 超声造影法检测两组原位移植瘤的血供情况
末次给药后第7天麻醉裸鼠，俯卧位置于操作台上，探头和裸鼠皮肤间涂以离心后的超声耦合剂。

经尾静脉团注超声造影剂20mL，随即推注0.2mL生理盐水，同时开始采集l min的造影全过程。

图像采集帧频30～37Hz，使用内置的超声造影分析软件在机分析，造影录像以DICOM的AVI格式导出，应用对比脉冲序列造影成像技术对肿瘤的血供进行定量评价。

以整个移植瘤为感兴趣区(region of interesting，ROI)，获得峰值强度(peak intensity，PI)参数。

1.2.４原位移植瘤数据采集
末次给药后第7天处死所有裸鼠，解剖胰腺原位移植瘤，比较肿瘤生长情况，分别测肿瘤长径及短径，并计算肿瘤体积，体积计算公式按照v=兀／6×a2×b（a为短径，b为长径）。

1.3 统计分析
所有数据用SPSS15．0统计软件包进行处理。

计量资料用(X±s)表示，两组均数比较用t检验，以P<0．05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 NCTD对裸鼠移植瘤体积、瘤重的影响用药前各组肿瘤平均体积及平均体重，差异均无统计学意义(P>O．05)。

用药后NCTD组裸鼠体重21.14±0.25g与NS组20.70±0.27g相比，差异无统计学意义(P>O．05)；而NCTD组的瘤体平均体积为(212.56±22.35)mm3、瘤体质量0.38±0.27g与NS组体积(318.78±34.25)mm3、瘤体质量0.62±0.25g相比，差异有统计学意义(P<O．05)。

实验过程中裸鼠体重及瘤重变化如表1示。

2.2 NCTD对裸鼠移植瘤血供影响通过对裸鼠肿瘤行超声造影检测，结果显示：用药后NSTD组肿瘤血供较对照组明显减少（见图1），用药前两组血流峰值（PI）无明显差异p＞0．05，用药后NSTD组肿瘤血供较对照组明显减少，NCTD组峰值强度为17.28±2.20db，NS组PI为41.05±1.78db（见表2），差异有统计学意义p<0．05)。

3 讨论
从中药中分离有效的抗癌活性成分是寻找新抗癌药物的有效途径之一。

NCTD是从中药斑蝥体内提取活性成分经化学改造而成的新型抗肿瘤药物，其抗肿瘤靶点众多，作用机制复杂，能够通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、抑制侵袭转移和调节免疫等多条途径抑制肿瘤的生长。

在对NCTD最初的研究中，多是从这些角度出发。

由于肿瘤的生长和转移必须依赖血管生成，有学者采用裸鼠移植瘤模型观察到NCTD可以抑制肝癌[1]胆囊癌［2］、乳腺癌［3］的血管生成。

本研究利用超声造影法检测实验组与对照组裸鼠原位移植瘤的血供情况，同样发现NCTD可明显减少裸鼠胰腺癌组织中的血管的生成。

证实NCTD可明显减少胰腺癌组织中的血管的生成。

这些证据都有力支撑了从抗血管生成这个角度来研究 NCTD 的抗肿瘤机制。

我们期望通过进一步的研究，阐明NCTD抑制胰腺癌血管生长的机制，明确NCTD 抑制胰腺癌生长及转移的作用，找到胰腺癌临床治疗的新方法。

参考文献：
[1].Zhang S J，Li G D，Ma X X，et al. Norcantharidin enhances ABT-737-induced apoptosis in hepatocellular carcinoma cells by transcriptional repression of Mcl-1［J］．Ellular Signalling，2012 ，24 ：1803－1809.
[2].范跃祖，陈春球，赵泽明，等畅去甲斑蝥素对胆囊癌肿瘤血管生成的作用及机制研究［J］中华医学杂志，2006，86（10）：693‐699.
[3].王景毅，梁金龙，刘国津.去甲斑蝥素对乳腺癌细胞血管内皮生长因子表达的影响［J］.中华中医药学刊，2009，27（11）：2369‐2371.。