葛根多糖的提取和含量测定及清除自由基分析

胶体渗透压。

3)HSC 分离后接种浓度和数量很重
要,浓度太低或数量少,消弱细胞自分泌和旁分泌的刺激作用,细胞难以生长。

操作过程中动作轻柔、无菌操作,以防止细胞损伤和污染,保证大鼠HS C 原代分离、培养成功。

4)第一步灌流时使用150～200m l 无钙灌流液,洗去肝脏中的血液细胞和肝细胞间质中的Ca
2+
,易于肝细胞的分离。

Ca 2+
又是维持胶原酶活性所必需,胶原酶灌流液中必需加钙。

5)DNA 酶用来消化肝细胞破坏所释放的D NA ,防止细胞粘连聚集。

6)为保证胶原酶最佳活性,灌流液pH 的和灌流速率要恒定,当灌流液流经肝脏时,酸化很快。

在灌流时须有一强有力的缓冲系统以维持灌流液pH 的恒定。

在灌流液中加入较高浓度的HEPES 来控制灌流液的pH,效果可靠。

肝脏对缺氧的耐受性较心脏强,因此灌流速率可降到5m l/m in 。

恒定的灌流速率可保证胶原酶到达肝脏所有的细胞间,获得良好的肝细胞的分离效果;7)为防止细菌污染,操作全程应用抗生素。

总之,本实验建立的肝脏原位灌注去除红细胞,离体酶灌注分离纯化大鼠及人体肝脏K C 的方法,在细胞得率、纯度及活性方面均能达到实验要求,为进一步实验奠定了基础,同时本实验稳定、经济、分离时间短。

原代培养的HSC 适用于研究相对静止的H S C 生物学行为,而传代培养的HSC 适用于研究活化的HS C 生物学行为。

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(收稿日期:2008211226)
文章编号:167322995(2009)0120010203
论　著
葛根多糖的提取和含量测定及清除自由基分析
刘朝晖,穆卫东,王　虹,韩丽琴3
　(吉林医药学院,吉林吉林　132013)
摘　要:目的　提取葛根中多糖并研究葛根多糖对氧自由基的清除作用。

方法　用水煮醇沉法提取葛根多糖,采用改良Sevag 法脱游离蛋白,用蒽酮2硫酸脱水并显色,以葡萄糖作对照品,在620nm 处测吸收度,在320nm 处测定多糖对邻苯三酚自氧化产生的氧自由基的清除率。

结果　葛根中多糖的含量为0.5885%,平均回收率为105%,对氧自由基具有清除率为33.07%。

结论　葛根多糖对自由基有清除作用,本方法提取葛根中多糖简便、快速、准确、重现性好,结果满意。

关　键　词:葛根;多糖;自由基
中图分类号:Q781 文献标识码:A
通讯作者韩丽琴(),女(锡伯族),副教授,硕士作者简介刘朝晖(5),男(汉族),本科—
01—第30卷　第1期2009年02月 吉　林　医　药　学　院　学　报Journa l of Jilin Medica l College Vol .30　No .1
Feb .2009
:1970-.:198-.
Abstraction of the polyos e from rad i ces puerar i re,m ea s urem en t of con ten ts an d ana lysis of r em ova l of oxygen fr ee rad ica ls
L IU Zhao2Hui,MU W ei2Dong,WANG Hong,HAN L i2qin3　(Jilin Medical College,Jilin City,J ilin P r ovince, 132013,China)
Abstrac t:O b j e ctive　To abstr act polyose fr om radices puerarir e and investigated its re moval functi on t o oxygen free radicals.Me thods　Polyose wa s abstracted by p r ecipitated alcohol,i mpr oved sevag m ethod was adop ted to re move pr ote ins,anthr one c olori m etr y was used to r emove wate r and the color was devel oped,compared w ith glucose,the ab2 sor pti on leve l wasm easur ed in the point of620n m,and the scavenging r a tio of Polysaccharide on oxygen fr ee r adicals w ith Pyroga llol Aut oxidation wasm ea sured in the point of320nm.R e su lts　The content of polysaccharides in radice s puerarire fruit wa s0.5885%.The average recovery rate was105%.The scavenging rati o was33.07%.Co nc l u si on The polyoses of radices puerarir e could ge t rid of oxygen fr ee radicals and abstrac tion was si mp le and convenient,f a st, accurate,with good rep r oductive qua lity,and satisfact ory.
Key wor ds:radices pue r a rir e;polyose;oxygen free r adicals
中药葛根为豆科多年生落叶藤本植物野葛pue r2 a ria lobata(willd.)ohwi或干葛藤pueraria thom s oni2 i B enth.的根。

葛根主产于四川,重庆,河南,河北等地;干葛藤习称“粉葛”,主产于广东、广西等地。

葛根含有葛根素(puararin)、大豆苷元(da idzein)、4′2甲氧基葛根素(4′-m ethoxy pucta rin)、多糖化合物、大豆苷元24′,72二葡萄糖苷等成分[1],本实验对葛根中多糖的含量进行测定,并测定其对邻苯三酚自氧化产生的氧自由基的清除率。

1　材料与方法
1.1　材料与仪器
葛根,市售;UV21200型紫外分光光度计,旋转蒸发仪;无水乙醇,乙醇,蒽酮,浓硫酸,葡萄糖,三氯甲烷,丙酮,石油醚,邻苯三酚,Tris2HCl缓冲溶液,实验用水为去离子水。

1.2　多糖的提取与测定
1.2.1　提取方法
将葛根粉碎,干燥24h后准确称取药品20g,置于索氏提取器中,120m l石油醚(60℃)回流至无色,换成120m l80%乙醇提取3h,取药渣挥干溶剂后,再以水煮4h,过滤,旋转蒸发仪上浓缩至30m l左右。

采用改良Sevag法脱游离蛋白,每次试剂与提取液混合搅拌～3,充分静止分层,数次后直到界面无白色沉淀为止。

取上层液体,加入3倍量5%乙醇使多糖析出,沉淀,减压抽滤得残渣,用去离子水定容50m l备用。

1.2.2　最大吸收波长确定
取0.1m g/m l的葡萄糖标准液0.40m l于10m l 试管中,去离子水补足至1m l;将全部试管置入冰水中,加入蒽酮显色剂3m l后同时摇匀,再将试管放入沸水浴中煮沸15m in取出,立即放入冰水中,冷却5m in后在室温中平衡10m in;用1cm比色皿,分别在不同吸收波长测定其吸光度值,通过对测量结果的分析,在620n m处有最大吸收值。

1.2.3　标准曲线的制备
取0.1m g/m l的葡萄糖标准液0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80m l于10m l试管中,去离子水补足至1m l;将全部试管放入冰水中,加入蒽酮显色剂3m l后同时摇匀,再将试管放入沸水浴中煮沸15m in取出,立即放入冰水中,冷却5m in后在室温中平衡10m in;用1cm比色皿620nm波长下测定。

绘制吸光度2浓度曲线,回归方程为
A=34.57C-0.0033,r=1.0000
1.2.4　样品测定
取样品液0.1m l加入10m l试管中,加入蒽酮显色剂3m l,摇匀,再将试管放入沸水浴中煮沸15m in 取出,立即放入冰水中,冷却5m in后室温平衡10m in,620nm波长下测定吸光度,计算多糖含量。

1.3　葛根多糖对超氧阴离子自由基的清除
3　邻苯三酚自氧化波长测定
容量瓶中加入5T2缓冲溶液,加入蒸馏水,3℃恒温预热5,迅速加入预热
—
11
—
第1期　刘朝晖,等.葛根多糖的提取和含量测定及清除自由基分析
200m in
924h 1..1
m l ris H Cl 4.70m l71m in
的邻苯三酚1m l,混合均匀迅速倒入比色皿,于200～450nm波长下扫描,得λ
max
=320nm。

1.3.2　葛根多糖清除超氧自由基测定
容量瓶中加入5m l Tris2HCl缓冲溶液, 0.2mmol/L样品液4m l,37℃恒温预热15m in,迅速加入预热的邻苯三酚1m l,反应4m in后加入0.5m l 浓盐酸终止反应,在320nm波长下测定吸收度,并计算葛根多糖对氧自由基的清除率E%。

E%=1-(未加邻苯三酚的溶液吸收度-加入样品和邻苯三酚的溶液吸收度)/未加样品的溶液吸收度×100%
2　结　果
测得葛根中多糖的含量为0.5885%,平均回收率为105%;对氧自由基清除率为33.07%。

3　讨　论
在水煮提取葛根可溶性多糖的过程中,温度是影响多糖提取的最关键因素[2]。

对多糖的测定采用蒽酮2硫酸法测定其吸收度[3],此法重现性好,灵敏度高,是一种简便、准确测定多糖的方法。

Sevag法去除蛋白质反应较为温和,但要达到除尽游离蛋白的目的,需进行反复多次的处理[4]。

蒽酮2硫酸试剂时要临用现配,否则颜色加深,会影响测定[5];加蒽酮2硫酸试剂要先将溶液在冰水中冷却,否则会影响测定结果。

脑梗塞是危害老年人健康的主要疾病之一。

如果血流迅速恢复使脑代谢改善,损伤细胞仍然可逆。

神经细胞仍可存活并恢复功能[6],对血小板聚集率高,微循环障碍者要持之以恒地进行抗凝防栓治疗[7]。

葛根为清凉解表的中药,具有解肌退热、生津透疹、升阳止泻之功效。

近年来研究证实葛根能明显改善脑微循环[8],葛根中提取物的临床应用非常广泛,具有防止高血压及动脉硬化、活血化瘀、抗肝脏毒、抗炎、祛痰、解热、提高机体免疫功能、抗菌、抗病毒、缓解高血压患者的头痛等多种药理作用[9]。

人体内自由基大量积累会对机体组织、器官、系统造成损害,加速机体衰老并诱发各种疾病。

而且随年龄的增长,机体内自由基也会因为代谢不完全而相对增多。

自由基清除剂能够清除机体多余自由基,对延缓衰老、预防疾病有非常重要的作用。

中药多糖在长期的临床应用和药理研究中表明具有很强的清除自由基的能力[10]。

葛根中多糖对氧自由基的清除率高,且具有来源广、抗氧化活性大、与机体亲和力强和安全性高等优点,在临床上有很好的应用前景。

多糖广泛存在于自然界,具有多种生物活性,是理想的免疫增强剂,它能激活免疫细胞,提高机体免疫力,不仅能促进T细胞、B细胞、NK细胞、LAK细胞等免疫细胞的功能,还能促进白介素、干扰素等细胞因子的产生[11]。

多糖还具有降低血糖、降血脂、抗血凝及止吐、抗衰老、抗辐射、抗病毒等生理活性。

本研究从葛根中提取粗多糖,并对其含量进行了测定,效果令人满意。

葛根多糖的结构组成和生理活性有待进一步研究。

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(收稿日期:2008210226)
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21
—吉林医药学院学报　2009年02月　第30卷。