第八讲二代测序技术(新)汇总.

Novel engineered polymerases
• tolerant of nucleotide modifications • high fidelity • efficient incorporation
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 3’ 5’
A
C G
T
C
A
T
G A
T
G
C
T G C T A C G A T A C C C G A T C G A T
• 引物扩增 • 利用专利的芯片：芯片表面连接有一
层单链引物（Primer），DNA片断成 单链后通过芯片表面的引物碱基互补 被一端“锚定”在芯片上 • 其一端“锚定”在芯片上，另外一端 （5’或3’）随机和附近的另外一个引 物互补，被“锚定”住，形成“桥 “(bridge) • 这样的反应在上千万DNA单分子上发 生
All four labelled nucleotides in one reaction
High accuracy Base-by-base sequencing No problems with
homopolymer repeats
Base calling from the raw data
ABI SOLiD™系统
Illumina Solexa Sequencing System
© 2006 Illumina, Inc. Illumina, Sentrix, Array of Arrays, BeadArray, DASL, Infinium, GoldenGate, BeadXpress, VeraCode, IntelliHyb, iSelect and Making Sense Out of Life are registered trademarks or trademarks of Illumina Inc.
• 基于单分子簇的边合成边测序技术，利用专利的可逆终止化学反 应原理。
将基因组DNA的随机片段“附着”到光学透明的玻璃表面（即 Flow cell），这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在Flow cell上 形成了数以亿计Cluster，每个Cluster是具有数千份相同模板的单 分子簇。
然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终 止的SBS（边合成边测序）技术对待测的模板DNA进行测序。
段被扩增成双链桥片
断，通过变性，释放
出互补的单链，锚定 到附近的固相表面(4,5)。 通过不断循环，将会 在Flow cell的固相表面 上获得上百万条成簇
分布的双链待测片断 (6)。
4.测序。 加入DNA聚合酶
和被荧光标记的 dNTP 和接头引物 进行扩增，在每 一个测序列簇延 伸互补链时，每 加入一个被荧光 标记的dNTP就能 释放出相应的荧 光，测序仪通过 捕获荧光信号， 并通过计算机软 件将光信号转化 为测序峰，从获 得待测片段的序 列信息 (7,8,9,10,11,12)。
1G
• Illumina Genome Analyzer (GA) IIx platform
具有极高的测序效率，每次运行可获得60G的数据， 一次可同时进行8个样本的测序，准确性高且成本 低。
可应用于基因组测序、BAC末端测序、表达谱制作、 小分子RNA鉴定等实验。
Illumina Solexa
Cluster station (CS)负责将待测样品 “种植”于检测芯片（flow cell） 中进行扩展
System Components
reagents
Software Consumables (Flowcell)
GA的发展历史
• GA与solexa 2006年11月1日，illumina收购Solexa GA：GA1\GAII\GAII X 不断升级 1G\35G\50G\ GA最早为1G analyzer，寓意其数据产量为
• Genomic DNA被打断成几百个碱基（或更短）， 并在两个末端加上接头的基因片段，按照一定浓 度进行稀释
• 将基因片段固定在flowcell上。由于芯片表面连接 有一层单链引物，经处理后的碱基片段与芯片十 来个的引物进行互补连接，被“固定”在芯片上
• 引物扩增，以样本为亲本链，使芯片引物延长形 成复制链
3、DNA簇在Genome Analyzer上边合成边测序 • 将Flowcell和试剂，安置到Genome Analyzer； • 全自动化完成测序，包括测序长Reads； • 图片处理，实时分析，碱基识别；
• 将基因组DNA打成几百个碱基（或更 短）的小片断，在片断的两个末端加 上接头(adapter)
Clonal Single Molecule Arrays
Prepare DNA fragments
Ligate adapters
Attach single molecules to surface Amplify to form clusters
20 microns
Sequence
~1000 molecules per ~ 1 µm cluster ~1000 clusters per 100 µm square ~40 million clusters per experiment
Reversible Terminator Chemistry
O HN
ON
PPP
O
3’
block
cleavage site fluor
Incorporation Detection
fluor removal
O
X
5’
HN
DNA O N
O
O
3’
Deblock
OH free 3’ end
Next cycle
Solexa测序应用
• 未知物种基因组的从头测序 • 已经测序物种的基因组重新测序 • 扩增产物重测序 • 基因组尺度转录组学分析 • 基因表达谱及基因调控研究 • 全基因组小分子RNA（miRNA）分析 • 染色质免疫互沉淀研究（ChIP） • 多重单核苷酸多型性（SNP）分析 • 甲基化研究 • 其他表观遗传学研究如磷酸化修饰 • 蛋白-DNA相互作用研究 • 染色体重排研究（缺失，插入，转位等）
• 形成的单链桥，以周围的引物为扩增 引物，在芯片表面进行扩增，形成双 链
• 双链经变性成单链，再次形成桥，成 为下一轮扩增的模板继续扩增反应
• 反复30轮扩增，每个单分子得到了 1000倍扩增，成为单克隆“DNA簇群”
• ”DNA簇群“在Genome Analyzer 综合分 析仪上进行序列分析
Cluster station 流程
SOLiD™ Sequencing by Oligonucleotide
Ligation and Detection
Applied Biosystems ABI
SOLiD高通量测序技术特点
• 无可匹敌的准确度：基于连接反应高度可靠的测序技术，创新的 双碱基编码技术，可选择性重复连接反应步骤。 系统的灵活性：两个独立控制的流动池，可以进行一张或二张玻 片的同时分析。开放式高密度磁珠沉置，每张玻片可分为1个，4 个或8个测序区域； 应用广泛灵活：超高通量的数据支持大规模测序和结构变异性分 析。独特的双碱基编码特性使系统具备自检功能，对单核苷酸多 态性（SNP）的检测精确率可以达到最高。以最大通量的标签实 验为应用的基础，可以为全转录组、染色质免疫共沉淀（ChIP） 和小RNA，甲基化研究等提供高度敏感的检测方法。
T G C TAC GAT …
1
2
3
4
5
6
7
8
9
TTTTTTTGT…
The identity of each base of a cluster is read off from sequential images
1.添加接头。 利用物理方法将待测样品DNA
打碎，在单链DNA碎片两端加上 接头。
2.表面结合。 利用微注射系统将已经加过
2006年美国Illumina公司推出的Solexa基因组分析平台（Genome Analyzer platform），
2007年ABI公司推出了自主研发的SOLiD 测序仪(ABI SOLiD sequencer)。
第二代高通量DNA测序技术
Roche 454 GS FLX系统 Illumina Solexa系统
• 确保高精确度和真实的一个碱基接一个碱基的测序，为同聚物和 重复序列的测序提供了一个很好的解决方案。
Solexa测序实验流程
1、样品制备 • 样品收集，基因组DNA打断 • DNA 末端修复 • 连接接头
2、DNA片段在Cluster Station上成簇扩增 • 准备Flowcell和试剂，安装到Cluster Station； • 将样品DNA连接到Flowcell； • 完全自动化完成Cluster制备；
• 使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能， 又被称为深度测序(deep sequencing)。
• 目前高通量测序平台的代表：
2005年454 Life Sciences公司（2007年该公司被Roche正式收购） 推出了454 FLX焦磷酸测序平台（454 FLX pyrosequencing platform ）;
Illumina Solexa特点
• 原始数据准确率 ≥ 98.5%，可有效地解决了多聚 重复序列的读取问题，如 AAAAAAAAAAAAAAAAA，TTTTTTTTTTTTT
• 样本使用效率高，对少量样本也可以极灵敏精 确地检测 （1ug DNA即可以进行末端双向测序 反应）
• DNA序列的读取长度不断增加，当前达到 150bp-300bp
接头的待测片断随机添加到玻璃 Flow Cell内，每一个Flow Cell又 分成8条Lane，带接头的待测片 段与单链引物互补配对，被固定， 随后单链引物引导复制链的形成。
3.桥型扩增循环获得多 拷贝待测DNA片断。
在Flow cell内加入未 被标记的dNTP和酶起 始固相桥型扩增(3)。 所有单链桥型待测片
• 可以进行Paib；
System Components
（早期）
Cluster Station
1G Genome Analyzer
Genome Analyzer (GA)负责对芯片 内的基因片段进行边合成边测序 反应，收集碱基信息
二代测序技术
φX174：全长5,368bp
Watson and Crick：DNA双螺旋 Fred Sanger：“DNA双脱氧链末端终止法”
PCR技术，4色荧光标记代替同位素 1990-毛细管凝胶电泳
AB:自动测序仪 3700 测序仪
深度测序(deep sequencing)
• 一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，又称为下一代 测序技术(next generation sequencing)。
Application
SOLID测序原理
• Applied Biosystemson） PCR和磁珠富集技术制备单分子模板，以四色 荧光标记寡核苷酸进行连续的连接反应为基础， 对扩增的DNA片段进行大规模高通量测序。测 序过程中同时使用了双碱基编码技术（twobase encoding），通过两个碱基来对应一个荧 光信号而不是传统的一个碱基对应一个荧光信 号，这样每一个位点都会被检测两次，出错率 明显降A 探索、重测序、3’, 5’-RACE、甲基化分析、ChIP测序 等。
5’
Sequencing-by-Synthesis (SBS)
Cycle 1: Add sequencing reagents First base incorporated Remove unincorporated bases Detect signal
Cycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat