血清中TMAO及其相关代谢物的检测方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010942745.5
(22)申请日 2020.09.09
(71)申请人 南京诺禾致源生物科技有限公司
地址 210000 江苏省南京市高新开发区江
北新区产业技术研创园浦滨路211号
扬子科创中心一期A幢10楼
(72)发明人 刘振东　王劲松　赵晓雯　刘莹　
李朋朋　
(74)专利代理机构 北京康信知识产权代理有限
责任公司 11240
代理人 白雪
(51)Int.Cl.
G01N 30/06(2006.01)
G01N 30/88(2006.01)
(54)发明名称血清中TMAO及其相关代谢物的检测方法(57)摘要本发明提供了一种血清中TMAO及其相关代谢物的检测方法。

该方法包括：S1，配制TMAO及其相关代谢产物的标准溶液；S2，选取两种氘代化合物作为内标，将蛋白沉淀剂和内标配制内标标准溶液；S3，将标准溶液与内标标准溶液混合，得到标准待测液；对标准待测液依次进行超高效液相色谱分离及质谱检测，获得标准曲线；S4，将待测血清和内标标准溶液混合，离心，取上清液作为待测样品；S5，对待测样品依次进行超高效液相色谱分离及质谱检测，与标准曲线进行比对，分别得到待测血清中TMAO及其相关代谢产物的含量。

本发明实现了对TMAO及其相关代谢产物的绝对定量，特异性强、灵敏度高、运行时间短、操
作简便快捷。

权利要求书2页 说明书8页 附图2页CN 111983112 A 2020.11.24
C N 111983112
A
1.一种血清中TMAO及其相关代谢物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，配制TMAO、左旋肉碱、甜菜碱、肌酸酐、胆碱的标准溶液；
S2，选取TMAO、左旋肉碱、甜菜碱、肌酸酐、胆碱中两种的氘代化合物作为内标，将蛋白沉淀剂和所述内标配制内标标准溶液；
S3，将所述标准溶液与所述内标标准溶液混合，得到标准待测液；对所述标准待测液依次进行超高效液相色谱分离及质谱检测，得到第一检测数据；根据所述第一检测数据，所述标准溶液中TMAO、左旋肉碱、甜菜碱、肌酸酐、胆碱的含量及所述标准待测液中所述内标的含量，获得标准曲线；
S4，将待测血清和内标标准溶液混合，离心，取上清液作为待测样品；
S5，对所述待测样品依次进行超高效液相色谱分离及质谱检测，得到第二检测数据，将所述第二检测数据与所述标准曲线进行比对，分别得到所述待测血清中TMAO、左旋肉碱、甜菜碱、肌酸酐、胆碱的含量。

2.根据权利要求1所述的血清中TMAO及其相关代谢物的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中，
所述标准溶液的TMAO浓度依次为5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml；
所述标准溶液的左旋肉碱标准溶液的浓度依次为5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml、10000ng/ml、50000ng/ml、100000ng/ml；
所述标准溶液的甜菜碱标准溶液的浓度依次为5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml、10000ng/ml；
所述标准溶液的肌酸酐标准溶液的浓度依次为5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml、10000ng/ml、50000ng/ml、100000ng/ml；
所述标准溶液的胆碱标准溶液的浓度依次为5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml。

3.根据权利要求2所述的血清中TMAO及其相关代谢物的检测方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述内标标准溶液的配制方法如下：配制每种所述内标的浓度均为1μg/ml的储备液，将所述储备液加入至所述蛋白沉淀剂中，形成每种所述内标的浓度均为50ng/ml的所述内标标准溶液。

4.根据权利要求3所述的血清中TMAO及其相关代谢物的检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述标准溶液与所述内标标准溶液混合的过程中，二者之间的体积比为1:4～1:5。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的血清中TMAO及其相关代谢物的检测方法，其特征在于，所述步骤S3和所述步骤S5的色谱分离过程采用的色谱条件如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 2.1×100mm 1.7μm；
流动相：A相、10mM乙酸铵水溶液；B相、乙腈；
柱温：50℃；
进样量：1～3μl。

6.根据权利要求5所述的血清中TMAO及其相关代谢物的检测方法，其特征在于，所述步骤S3和所述步骤S5的质谱检测过程中，采用的质谱条件如下：
电喷雾电离源，正离子电离模式；离子源温度500℃、离子源电压5500V、气帘气35psi、
雾化气和辅助气均为50psi；采用多重反应监测进行扫描。

7.根据权利要求6所述的血清中TMAO及其相关代谢物的检测方法，其特征在于，所述内标为左旋肉碱的氘代化合物以及肌酸酐的氘代化合物；所述步骤S3和所述步骤S5的质谱检测过程中，检测参数如下：
TMAO的母离子为76.1，子离子为58.1Da和42.1Da，驻留时间为15msec，去簇电压为40volts，碰撞电压为25volts和47volts；
肉碱的母离子为114Da，子离子为44.1Da和86.1Da，驻留时间为15msec，去簇电压为35volts，碰撞电压为28volts和16volts；
甜菜碱的母离子为118Da，子离子为59.1Da和42.1Da，驻留时间为15msec，去簇电压为47volts，碰撞电压为24volts和71volts；
肌酸酐的母离子为162.1Da，子离子为103.2Da和58.1Da，驻留时间为15msec，去簇电压为47volts，碰撞电压为22volts和60volts；
胆碱的母离子为104.1Da，子离子为60.1Da和45.1Da，驻留时间为15msec，去簇电压为40volts，碰撞电压为23volts和30volts；
肉碱的氘代化合物的母离子为117.1Da，子离子为89.1Da和43.1Da，驻留时间为15msec，去簇电压为40volts，碰撞电压为17volts和52volts；
肌酸酐的氘代化合物的母离子为171.2Da，子离子为103.1Da和85.1Da，驻留时间为15msec，去簇电压为40volts，碰撞电压为23volts和28volts。

8.根据权利要求5所述的血清中TMAO及其相关代谢物的检测方法，其特征在于，所述步骤S4中，将所述待测血清和所述内标标准溶液混合的过程中，同时加入色谱分离的B相溶剂，且所述待测血清与所述B相溶剂之间的体积比为5:1～4:1。

9.根据权利要求1至4中任一项所述的血清中TMAO及其相关代谢物的检测方法，其特征在于，所述TMAO标准溶液的稀释相为乙腈，所述内标标准溶液的稀释相为乙腈。

10.根据权利要求1至4中任一项所述的血清中TMAO及其相关代谢物的检测方法，其特征在于，所述蛋白沉淀剂为甲醇和/或乙腈中的一种或多种。

血清中TMAO及其相关代谢物的检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物分析技术领域，具体而言，涉及一种血清中TMAO及其相关代谢物的检测方法。

背景技术
[0002]氧化三甲胺(TMAO)，是一种广泛存在于海产品中的甲胺类化合物，参与机体多种重要的生物学功能，包括调节渗透压、稳定蛋白质结构、诱食和促生长等作用。

人体中的TMAO水平除受摄食含有TMAO的海产品影响外，还可通过摄食胆碱在体内代谢而产生，在摄入富含胆碱的食物后，大部分在肠道中的微生物菌群作用下生成三甲胺(TMA)，TMA随着血液循环系统进入肝脏，而肝脏中含有黄素单氧化酶，在肝黄素单氧化酶的作用下TMA被氧化生成TMAO。

[0003]近年来，随着对肠道菌群研究的深入，发现TMAO及其代谢物的水平与心血管疾病、心梗死、卒中、糖尿病、慢性肾病、癌症等多种疾病密切相关，而对TMAO的深入研究为探索TMAO代谢、相关疾病发病机理、诊断、治疗及预防等方面提供了重要的参考价值，因此实现对血清中TMAO及其代谢物的绝对定量为临床诊断、科学研究等领域提供了可靠的依据。

[0004]目前LC-MS方法大多只能检测TMAO一种物质，并不涉及相关代谢及前体的检测，导致检测结果不全面，准确度不可靠。

除此之外的检测技术还包括毛细管电泳法、气质联用法及酶联免疫法等，然而毛细管电泳法重复性较差，不宜采用；气质联用法灵敏度虽高，但存在局限性，还需对目标化合物进行衍生等手段，操作繁琐，也不宜采用；酶联免疫法被广泛使用，但其反应原理是会造成抗体间的交叉反应，该缺陷导致方法的灵敏度不高，所以也不宜采用，
[0005]总之，现有技术大多只能检测TMAO一种物质，且操作过程较繁琐，检测结果不全面，准确度极不可靠。

发明内容
[0006]本发明的主要目的在于提供一种血清中TMAO及其相关代谢物的检测方法，以解决现有技术中血清中TMAO检测时存在的只能检测TMAO一种物质、操作过程较繁琐、检测结果不全面、准确度不可靠等问题。

[0007]为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种血清中TMAO及其相关代谢物的检测方法，其包括以下步骤：S1，配制TMAO、左旋肉碱、甜菜碱、肌酸酐、胆碱的标准溶液；S2，选取TMAO、左旋肉碱、甜菜碱、肌酸酐、胆碱中两种的氘代化合物作为内标，将蛋白沉淀剂和内标配制内标标准溶液；S3，将标准溶液与内标标准溶液混合，得到标准待测液；对标准待测液依次进行超高效液相色谱分离及质谱检测，得到第一检测数据；根据第一检测数据，标准溶液中TMAO、左旋肉碱、甜菜碱、肌酸酐、胆碱的含量及标准待测液中内标的含量，获得标准曲线；S4，将待测血清和内标标准溶液混合，离心，取上清液作为待测样品；S5，对待测样品依次进行超高效液相色谱分离及质谱检测，得到第二检测数据，将第二检测数
据与标准曲线进行比对，分别得到待测血清中TMAO、左旋肉碱、甜菜碱、肌酸酐、胆碱的含量。

[0008]进一步地，步骤S1中，标准溶液的TMAO浓度依次为5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml；标准溶液的左旋肉碱标准溶液的浓度依次为5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml、10000ng/ml、50000ng/ml、100000ng/ml；标准溶液的甜菜碱标准溶液的浓度依次为5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml、10000ng/ml；标准溶液的肌酸酐标准溶液的浓度依次为5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml、10000ng/ml、50000ng/ml、100000ng/ml；标准溶液的胆碱标准溶液的浓度依次为5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml。

[0009]进一步地，步骤S2中，内标标准溶液的配制方法如下：配制每种内标的浓度均为1μg/ml的储备液，将储备液加入至蛋白沉淀剂中，形成每种内标的浓度均为50ng/ml的内标标准溶液。

[0010]进一步地，步骤S3中，标准溶液与内标标准溶液混合的过程中，二者之间的体积比为1:4～1:5。

[0011]进一步地，步骤S3和步骤S5的色谱分离过程采用的色谱条件如下：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 2.1×100mm 1.7μm；流动相：A相、10mM乙酸铵水溶液；B相、乙腈；柱温：50℃；进样量：1～3μl。

[0012]进一步地，步骤S3和步骤S5的质谱检测过程中，采用的质谱条件如下：电喷雾电离源，正离子电离模式；离子源温度500℃、离子源电压5500V、气帘气35psi、雾化气和辅助气均为50psi；采用多重反应监测进行扫描。

[0013]进一步地，内标为左旋肉碱的氘代化合物以及肌酸酐的氘代化合物；步骤S3和步骤S5的质谱检测过程中，检测参数如下：TMAO的母离子为76.1，子离子为58.1Da和42.1Da，驻留时间为15msec，去簇电压为40volts，碰撞电压为25volts和47volts；肉碱的母离子为114Da，子离子为44.1Da和86.1Da，驻留时间为15msec，去簇电压为35volts，碰撞电压为28volts和16volts；甜菜碱的母离子为118Da，子离子为59.1Da和42.1Da，驻留时间为15msec，去簇电压为47volts，碰撞电压为24volts和71volts；肌酸酐的母离子为162.1Da，子离子为103.2Da和58.1Da，驻留时间为15msec，去簇电压为47volts，碰撞电压为22volts 和60volts；胆碱的母离子为104.1Da，子离子为60.1Da和45.1Da，驻留时间为15msec，去簇电压为40volts，碰撞电压为23volts和30volts；肉碱的氘代化合物的母离子为117.1Da，子离子为89.1Da和43.1Da，驻留时间为15msec，去簇电压为40volts，碰撞电压为17volts和52volts；肌酸酐的氘代化合物的母离子为171.2Da，子离子为103.1Da和85.1Da，驻留时间为15msec，去簇电压为40volts，碰撞电压为23volts和28volts。

[0014]进一步地，步骤S4中，将待测血清和内标标准溶液混合的过程中，同时加入色谱分离的B相溶剂，且待测血清与B相溶剂之间的体积比为5:1～4:1。

[0015]进一步地，TMAO标准溶液的稀释相为乙腈，内标标准溶液的稀释相为乙腈。

[0016]进一步地，蛋白沉淀剂为甲醇和/或乙腈中的一种或多种。

[0017]本发明基于超高效液相色谱质谱联用技术并引入氘代内标，实现了对TMAO及其相关代谢产物肉碱(Carnitine)、甜菜碱(Betaine)、肌酸酐(Creatinine)、胆碱(Choline)的
绝对定量，本方法特异性强、灵敏度高、运行时间短、操作简便快捷，具有优异的精密度、准确度及稳定性，适合样本的高通量分析及筛选，弥补了目前检测技术尚存缺陷的这一技术缺口，对于整个生物学具有里程碑的意义。

附图说明
[0018]构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

在附图中：[0019]图1从上到下分别为本发明实施例1的胆碱(1)、左旋肉碱(2)、氧化三甲胺(3)、甜菜碱(4)以及肌酸酐(5)这5种标准品待测液在500ng/ml经过液质联用检测得到的的色谱峰图。

[0020]图2从上到下分别为本发明实施例1的通过步骤3得到的左旋肉碱(1)和肌酸酐(2)的标准曲线。

具体实施方式
[0021]需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

[0022]正如背景技术部分所描述的，血清中TMAO的检测方法，其包括以下步骤：S1，配制TMAO、左旋肉碱、甜菜碱、肌酸酐、胆碱的标准溶液；S2，选取TMAO、左旋肉碱、甜菜碱、肌酸酐、胆碱中两种的氘代化合物作为内标，将蛋白沉淀剂和内标配制内标标准溶液；S3，将标准溶液与内标标准溶液混合，得到标准待测液；对标准待测液依次进行色谱分离及质谱检测，得到第一检测数据；根据第一检测数据，标准溶液中TMAO、左旋肉碱、甜菜碱、肌酸酐、胆碱的含量及标准待测液中内标的含量，获得标准曲线；S4，将待测血清和内标标准溶液混合，离心，取上清液作为待测样品；S5，对待测样品依次进行超高效液相色谱分离及质谱检测，得到第二检测数据，将第二检测数据与标准曲线进行比对，分别得到待测血清中TMAO、左旋肉碱、甜菜碱、肌酸酐、胆碱的含量。

[0023]TMAO及其代谢物均属于强极性分子，在常规的反相色谱柱上保留较差，对分析和定量都造成困扰，而本发明使用超高液相色谱和质谱(UPLC-MS/MS)联用可以在很短的时间内对TMAO及其代谢物实现良好分离，特异性强，通道之间互不干扰，引入先进的同位素内标技术，使得定量结果更为准确。

同时，TMAO在血清中的含量极高，很容易造成质控品失控和仪器的检测器饱和，从而引发方法学验证失败、定量结果不可靠等问题。

本发明在样本处理上引入稀释法和蛋白沉淀法，将复杂的成分变的更加的简单化，使得目标化合物在色谱图上展现出的峰型更加完美，有益于谱图的分析及准确定量。

同时，本发明引入氘代内标，可以同时检测TMAO及其代谢物，检测结果较全面，整个过程耗时短，提取效率高，很好的解决了基质效应的问题。

[0024]总之，本发明基于超高效液相色谱质谱联用技术并引入氘代内标，实现了对TMAO 及其相关代谢产物左旋肉碱(L-Carnitine)、甜菜碱(Betaine)、肌酸酐(Creatinine)、胆碱(Choline)的绝对定量，本方法特异性强、灵敏度高、运行时间短、操作简便快捷，具有优异的精密度、准确度及稳定性，适合样本的高通量分析及筛选，弥补了目前检测技术尚存缺陷的这一技术缺口，对于整个生物学具有里程碑的意义。

[0025]上述根据第一检测数据，标准溶液中TMAO、左旋肉碱、甜菜碱、肌酸酐、胆碱的含量及标准待测液中内标的含量，获得标准曲线的过程包括：进行液质联用检测后，以每个标准品浓度与内标浓度的比值作为横坐标，以每个浓度点检测到的标准品峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，绘制出的曲线。

[0026]为了进一步提高检测准确性，在一种优选的实施方式中，步骤S1中，步骤S1中，标准溶液的TMAO浓度依次为5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml；标准溶液的左旋肉碱标准溶液的浓度依次为5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml、10000ng/ml、50000ng/ml、100000ng/ml；标准溶液的甜菜碱标准溶液的浓度依次为5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml、10000ng/ml；标准溶液的肌酸酐标准溶液的浓度依次为5ng/ml、10ng/ml、50ng/ ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml、10000ng/ml、50000ng/ml、100000ng/ml；标准溶液的胆碱标准溶液的浓度依次为5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml。

[0027]在一种优选的实施方式中，步骤S2中，内标标准溶液的配制方法如下：配制每种内标浓度为均为1μg/ml内标的储备液，将储备液加入至蛋白沉淀剂中，形成每种内标浓度均为50ng/ml的内标标准溶液。

加入蛋白沉淀剂，在后续的样品检测过程中，利用蛋白沉淀剂能够将样本中的复杂成分简单化，减少对目标成分的检测影响，有利于减轻检测过程中的基质效应。

[0028]出于进一步提高内标和标准溶液中TMAO浓度适配性，从而进一步提高检测可靠性的目的，在一种优选的实施方式中，步骤S3中，标准溶液与内标标准溶液混合的过程中，二者之间的体积比为1:4～1:5。

[0029]在一种优选的实施方式中，步骤S3和步骤S5的色谱分离过程采用的色谱条件如下：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 2.1×100mm 1.7μm；流动相：A相、10mM乙酸铵水溶液；B相、乙腈；柱温：50℃；进样量：1～3μl。

利用超高液相色谱分离搭配上述极性保留机制的色谱柱，在以上条件下具有更好的色谱分离效果，对于最终的检测准确性也具有更好的促进作用。

[0030]在一种优选的实施方式中，步骤S3和步骤S5的质谱检测过程中，采用的质谱条件如下：电喷雾电离源，正离子电离模式；离子源温度500℃、离子源电压5500V、气帘气35psi、雾化气和辅助气均为50psi；采用多重反应监测进行扫描。

[0031]在一种优选的实施方式中，内标为肉碱的氘代化合物以及肌酸酐的氘代化合物；步骤S3和步骤S5的质谱检测过程中，检测参数如下(均为检测过程中输入的参数)：TMAO的母离子为76.1Da，子离子为58.1Da和42.1Da，驻留时间为15msec，去簇电压为40volts，碰撞电压为25volts和47volts；肉碱的母离子为114Da，子离子为44.1Da和86.1Da，驻留时间为15msec，去簇电压为35volts，碰撞电压为28volts和16volts；甜菜碱的母离子为118Da，子离子为59.1Da和42.1Da，驻留时间为15msec，去簇电压为47volts，碰撞电压为24volts和71volts；肌酸酐的母离子为162.1Da，子离子为103.2Da和58.1Da，驻留时间为15msec，去簇电压为47volts，碰撞电压为22volts和60volts；胆碱的母离子为104.1Da，子离子为60.1Da 和45.1Da，驻留时间为15msec，去簇电压为40volts，碰撞电压为23volts和30volts；肉碱的氘代化合物的母离子为117.1Da，子离子为89.1Da和43.1Da，驻留时间为15msec，去簇电压
为40volts，碰撞电压为17volts和52volts；肌酸酐的氘代化合物的母离子为171.2Da，子离子为103.1Da和85.1Da，驻留时间为15msec，去簇电压为40volts，碰撞电压为23volts和28volts。

[0032]在一种优选的实施方式中，步骤S4中，将待测血清和内标标准溶液混合的过程中，同时加入色谱分离的B相溶剂，且待测血清与B相溶剂之间的体积比为5:1～4:1。

使用上述B 向溶剂也能够进一步达到对待测血清的稀释作用，进一步减轻基质效应。

[0033]在一种优选的实施方式中，TMAO标准溶液的稀释相为乙腈，内标标准溶液的稀释相为乙腈。

[0034]在一种优选的实施方式中，蛋白沉淀剂为甲醇和/或乙腈中的一种或多种。

[0035]以下结合具体实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。

[0036]实施例1
[0037]一、检测过程
[0038]1、TMAO及其相关代谢物标准溶液配制
[0039]用移液器分别移取TMAO、左旋肉碱、甜菜碱、肌酸酐、胆碱母液(1mg/ml)各100μl，加入乙腈500μl，混匀，制得浓度为100000ng/ml的线性母液1，稀释液为乙腈，按照以下步骤稀释得到其余线性点母液。

[0040]线性母液1(100000ng/ml)—线性母液2(50000ng/ml)—线性母液4(5000ng/ml)—线性母液6(500ng/ml)—线性母液8(50ng/ml)—线性母液10(5ng/ml)；
[0041]线性母液1(100000ng/ml)—线性母液3(10000ng/ml)—线性母液5(1000ng/ml)—线性母液7(100ng/ml)—线性母液9(10ng/ml)—线性母液10(5ng/ml)。

[0042]以上各线性母液记为不同TMAO及其相关代谢物的标准溶液。

[0043]2、内标标准溶液
[0044]先将1mg/ml的2种内标母液(分别为左旋肉碱氘代内标和肌酸酐氘代内标)稀释成浓度各自为1μg/ml的内标储备液，从其中再各吸取一定体积加入到蛋白沉淀剂乙腈中最终形成每种内标浓度均为50ng/ml内标工作溶液。

[0045]3、获得标准曲线
[0046]将各TMAO及其相关代谢物标准溶液与内标标准溶液按照体积比1:5混合，形成标准待测液；对标准待测液依次进行超高效液相色谱分离及质谱检测，得到第一检测数据，即每种标准品及内标在不同浓度点分别测得的峰面积；根据第一检测数据，以每个标准品浓度与内标浓度的比值作为横坐标，以每个浓度点检测到的标准品峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，获得标准曲线。

[0047]4、血清样本检测
[0048]用移液器移取待测血清50μl，加入10μl乙腈，涡旋混匀1min，加入以上内标标准溶液250μl，涡旋混匀5min，离心(12000rpm，10min)后取上清液，收集，待上机检测。

[0049]5、样本检测
[0050]将步骤4中得到的上清液作为待测样品，依次进行超高效液相色谱分离及质谱检测，得到第二检测数据，将第二检测数据与所述标准曲线进行比对，得到待测血清中TMAO、左旋肉碱、甜菜碱、肌酸酐、胆碱的各自含量。

[0051]色谱条件如下：
[0052]色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 2.1×100mm 1.7μm
[0053]流动相：A相：10mM乙酸铵水溶液
[0054]B相：乙腈
[0055]柱温：50℃
[0056]进样量：2μl
[0057]色谱梯度如下表所示：
[0058]表1
[0059]Time(min)Flow(ml/min)A％B％
00.32575
0.50.32575
0.80.33070
20.33070
2.50.35050
30.35050
3.010.32575
50.32575
[0060]质谱条件如下：
[0061]电喷雾电离(ESI)源，正离子电离模式。

离子源温度500℃,离子源电压5500V，气帘气35psi，雾化气和辅助气均为50psi。

采用多重反应监测(MRM)进行扫描。

下表为5种标准品和内标的质谱检测参数。

[0062]表2
[0063]
[0064]
[0065]注：Q1为母离子，Q3为子离子，DP为去簇电压，CE为碰撞电压，Dwell time为驻留时间。

[0066]检测结果见图1和图2，其中，
[0067]图1中，5个图从上到下分别为氧化三甲胺、甜菜碱、肌酸酐、左旋肉碱、以及胆碱这5种标准品待测液在500ng/ml(即实施例1中标准曲线的第五个浓度点)经过液质联用检测得到的的色谱峰图。

从图中可以看出，5种物质可以在色谱层面实现很好的分离，峰宽在10s 左右，峰型良好。

[0068]图2中上下两幅图分别是实施例1中通过步骤3得到的左旋肉碱和肌酸酐的标准曲线，横坐标是标准品浓度与内标浓度的比值，纵坐标是每个浓度点检测到的标准品峰面积与内标峰面积的比值。

[0069]在上述检测过程中，为了进行质量控制，考察检测的可靠性，还进行了以下步骤：[0070]质控溶液配制：高、中、低质控溶液配制方法与线性母液5、线性母液7、线性母液9配制方法相同。

[0071]空白基质及质控品的制备：在20ml人血浆中加入3g活性炭，在25℃情况下震荡过夜，离心(12000rpm，10min)，取上清，上清液用0.22μm滤膜过滤，然后根据所需从中吸取一定体积的溶液，用生理盐水或纯水稀释10倍即得到实验所需的质控品。

[0072]线性前处理：用移液器移取质谱水50μl，分别加入线性母液1至线性母液10溶液10μl，涡旋混匀1min，加入含有内标的蛋白沉淀剂(乙腈)250μl，涡旋混匀5min，离心(12000rpm，10min)后取上清液，收集，待上机检测。

[0073]质控样品前处理：用移液器移取空白基质50μl，分别加入低中高(10ng/ml、100ng/ ml、1000ng/ml)质控溶液10μl，涡旋混匀1min，加入含有内标的蛋白沉淀剂(乙腈)250μl，涡旋混匀5min，离心(12000rpm，10min)后取上清液，收集，待上机检测。

[0074]空白基质前处理：用移液器移取空白基质50μl，加入10μl乙腈，涡旋混匀1min，加入含有内标的蛋白沉淀剂(乙腈)250μl，涡旋混匀5min，离心(12000rpm，10min)后取上清液，收集，待上机检测。

[0075]检测条件同前文。

[0076]二、方法学验证及结果
[0077]上述检测过程中根据以下可靠性判断标准进行：
[0078]定量下限：样品中目标物能被定量测定的最低量，一般为标准曲线最低点。

要求信噪比值大于等于10(S/N≥10)；定量下限平行3组检测结果CV≤20％。

[0079]线性：在给定的测量范围内，测量结果与样品中目标物浓度成比例关系的程度。

要求相关系数r≥0.9900；各个目标物最低点的3组线性点检测结果CV≤20％，其他点的3组线性点检测结果CV≤15％。

[0080]基质效应：样品中除目标物以外的组分，由于基质常常对目标物的分析过程有显。