生物素亲与素系统有关技术课件
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生物素亲与素系统有关技术课件
活化生物素可与不同的大分子物质结合， 应根据可标记基团的种类及特性，选择 相应的活化生物素； 抗体：BNHS 偏酸性抗原：BHZ 核酸：光生物素
生物素亲与素系统有关技术课件
一个蛋白质分子可联结多个生物素分子， 即生物素化大分子具有多价性，它是 BAS多级放大作用的物质基础。
生物素亲与素系统有关技术课件
一）生物素及活化生物素
(一)生物素
1 概念： 生物素(biotin)是动、植物体内广泛分 布的一种小分子生长因子，又名辅酶R 或维生素H。
2.分子式： C10H16O3N2S 分子量：244.31
生物素亲与素系统有关技术课件
3.结构： 结合亲和素
咪唑酮环
结合蛋白质
生物素亲与素系统有关技术课件
+A-E
生物素亲与素系统有关技术课件
3 ABC法：
⑴ A+B·☼
⑵ Ag+Ab·B ABC
A- B·☼ ----------ABC
Ag-Ab·B ABC Ag-Ab·B-
特点：是在BAB法基础上的改良，将BAB
法中的A先与B-E结合，制备成复合物
生物素亲与素系统有关技术课件
+ B-E + A
ABC
PCR具有很强的放大能力，其可以定量地检 测DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特异 性，因此，将与抗原结合的特异抗体通过连接 分子与DNA结合，再经PCR扩增，由此定量检 测抗原使敏感性生物高素亲于与素E系L统I有S关A技和术课R件 IA。
免疫-PCR
一、主要程序
1. 抗原+生物素化抗体→抗原-生物素化抗 体复合物；
+ABC
ABC法在夹心ELISA中的应用 生物素亲与素系统有关技术课件
三、 生物素-亲和素系统的应用
1、BAS在酶免疫技术中的应用 2、BAS在荧光免疫技术中的应用 3、BAS在放射免疫技术中的应用 4、 BAS在分子生物学中的应用
生物素亲与素系统有关技术课件
免疫-PCR
免疫PCR是在ELISA的基础上建立起来的新方 法，用PCR扩增代替ELISA的酶催化底物显色。
但每个蛋白质上标记的生物素分子数量 应控制在一定范围。
每个抗原标记1-3个生物素分子为宜； 每个抗体标记3-5个生物素分子为宜； 生物素：Ig生G物素(亲m与g素系/m统有g关)技=术2课:件1，效果较好。
一、生物素-亲和素系统（BAS）
一) 生物素及活化生物素 二) 亲和素及链霉亲和素 三) 生物素-亲和素系统的特点
生物素亲与素系统有关技术课件
1.特异三性）强生：物素-亲和素系统的特点
亲和素和生物素间的高亲和力。
2.灵敏度高：
每个亲和素分子可与四个生物素结合； 生物素化大分子具多价性。
3.快速、稳定： 4.应用广泛：
可与酶、荧光素、胶体金等多类标记技术结合；
生物素亲与素系统有关技术课件
二、 BAS的基本类型及原理
生物素亲与素系统有关技术课件
A Monoclonal-AntibodyEnzymeImmunoassayfor Detection of HepatitisB Surface Antigen with Use of a Biotin-AvidinCSLyINstIeCmAL CHEMISTRY, 1985,31(2):202-
2.分子量：65 000 3.结构：由4个相同的肽链组成，甘氨酸和丙
氨酸含量较大 。
生物素亲与素系统有关技术课件
4.特性：1个亲和素分子可结合4个生物素分 子。
5.亲和常数：1018/mol 6.优点：为弱酸性蛋白（PI=6.0），不含糖基，
因此与聚苯乙稀的非特异性吸附远低于亲 和素，因此应用广泛。
生物素亲与素系统有关技术课件
二）亲和素和链霉亲和素
(一) 亲和素(avidin，A)
1.概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳 水化物的碱性糖蛋白。
2.分子量：68 000 3.结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白，
富含色氨酸，它是与生物素结合的基团。
生物素亲与素系统有关技术课件
4.特性：每个亚基都可结合1个生物素分子， 即1个亲和素分子可结合4个生物素分子。
PCR产物每轮循环增加一倍
30轮循环
扩增量达230个拷贝（109拷贝）
生物素亲与素系统有关技术课件
二、免疫PCR的发展
免疫PCR技术目前尚处于研究阶段，应 用的还不多；
实验表明免疫PCR的敏感性比ELISA高 105倍，且PCR产生的背景信号很弱，可 以检测到几百个分子的抗原，在理论上 免疫PCR可以检测到一个分子抗原，因 此，免疫PCR特别适用于检测一些含量 特别少亲与素系统有关技术课件
1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺 酯（BNHS）、长臂活化生物素 （BCNHS）。
2.标记蛋白质醛基：酰肼（BHZ）和肼 化生物胞素（BCHZ）。
3.标记蛋白质巯基：3-（N-马来酰亚胺丙酰）-生物胞素（MPB）。
生物素亲与素系统有关技术课件
可有Ag与Ab反应的各种免疫方法：夹 心法、间接法、竞争法等，在此基础上 引入A-B系统。 BAB法： BA法： ABC法：
生物素亲与素系统有关技术课件
1 BAB法： Ab·B A Ab·B-A B·☼ Ab·B-A-
B·☼
特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E；
Ab·B和A-B的两次放大效应，可提高灵
2. 加亲合素→抗原-生物素化抗体-亲合素 复合物；
3. 加生物素化DNA→抗原-生物素化抗体亲合素-生物素化DNA；
4. PCR扩增生物素化DNA部分。
生物素亲与素系统有关技术课件
引物
5’
3’
3’
5’
变性、退火
延伸
变性、退火
延伸
PCR扩增原理 生物素亲与素系统有关技术课件
PCR技术具有高度的灵敏性
5.亲和常数：1015/mol 6.缺点：由于是碱性蛋白（PI=10），且含
糖基，与聚苯乙烯的非特异性吸附较高， 会导致本底增大，降低检测灵敏度。
A
生物素亲与素系统有关技术课件
二）亲和素和链霉亲和素
(二)链霉亲和素(streptavidin，SA) ：
1.概念：是从链球菌属的菌培养液中提取的一 种蛋白质。
205 Definition of Three Serotypes of Hantaviruses by a Double Sandwich ELISA with Biotin-Avidin Amplification System
J. gen. Virol. 1985, 66, 1733-1740.
双抗体夹心生物素．亲和素ELISA法检测相思子毒素
免疫学杂志,2007,23(5):571-574
生物素亲与素系统有关技术课件
我是亲和素，我来了
生物素亲与素系统有关技术课件
1）生物素分子较小，与蛋白质结合后，由于
大分(二子)蛋活白化质生的物空素间位阻效应，可影响生物素
与亲和素间的结合； 2）生物素只能依靠肽键与蛋白质上的氨基结
合。 因此，活化生物素可克服以上缺点，既减少
空间位阻效应，又可扩大其结合的对象。
生物素亲与素系统有关技术课件
1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺
酯（BNHS）、长臂活化抗生体中物性素和偏碱性
（BCNHS）。
蛋白的标记
生物素亲与素系统有关技术课件
2.标记蛋白质醛基：生物素酰肼 （BHZ）、肼化生物胞素（用B于C偏H酸Z）性糖蛋
白的生物素标记
生物素亲与素系统有关技术课件
(三)生物素标记蛋白质
标记对象： 大分子活性物质：如抗原、抗体。标记 后不影响免疫活性。 酶：如HRP、葡萄糖氧化酶和ALP等。 会降低ALP的活性。
生物素亲与素系统有关技术 课件
生物素亲与素系统有关技术课件
主要内容
生物素-亲和素系统简单介绍
了解
BAS基本类型和反应原理 对不起，哥是重点！ 生物素和亲和素放大系统的应用
了解
生物素亲与素系统有关技术课件
一、生物素-亲和素系统（BAS）
一) 生物素及活化生物素 二) 亲和素及链霉亲和素 三) 生物素-亲和素系统的特点
SA
生物素亲与素系统有关技术课件
二）亲和素和链霉亲和素
(三 ) 亲和素的标记
标记对象： 大分子物质：如酶、抗原和抗体。 小分子物质：胶体金、FITC和化学发
光物等。
生物素亲与素系统有关技术课件
一、生物素-亲和素系统（BAS）
一) 生物素及活化生物素 二) 亲和素及链霉亲和素 三) 生物素-亲和素系统的特点
敏度。
生物素亲与素系统有关技术课件
+A ++A
BAB法在夹心ELISA中的应用
生物素亲与素系统有关技术课件
2 BA法：
Ab·B A·☼ Ab·B-A·☼
特点：省略加标记生物素步骤，操作较 BAB法简便；Ab·B的放大效应，该法 有相当高的灵敏度。
生物素亲与素系统有关技术课件
BA法在间接ELISA中的应用
噻吩环 （CH2）4COOH
why
why
为什么 要对生物素 进行活化？
为什么 要对生物素 进行活化？
why
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我
可
以
我
是
是
抗
生
体，
物
也
素
可
以
是
酶
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我是亲和素，我来了
生物素亲与素系统有关技术课件
Broken Heart
生物素亲与素系统有关技术课件
活化生物素可与不同的大分子物质结合， 应根据可标记基团的种类及特性，选择 相应的活化生物素； 抗体：BNHS 偏酸性抗原：BHZ 核酸：光生物素
生物素亲与素系统有关技术课件
一个蛋白质分子可联结多个生物素分子， 即生物素化大分子具有多价性，它是 BAS多级放大作用的物质基础。
生物素亲与素系统有关技术课件
一）生物素及活化生物素
(一)生物素
1 概念： 生物素(biotin)是动、植物体内广泛分 布的一种小分子生长因子，又名辅酶R 或维生素H。
2.分子式： C10H16O3N2S 分子量：244.31
生物素亲与素系统有关技术课件
3.结构： 结合亲和素
咪唑酮环
结合蛋白质
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+A-E
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3 ABC法：
⑴ A+B·☼
⑵ Ag+Ab·B ABC
A- B·☼ ----------ABC
Ag-Ab·B ABC Ag-Ab·B-
特点：是在BAB法基础上的改良，将BAB
法中的A先与B-E结合，制备成复合物
生物素亲与素系统有关技术课件
+ B-E + A
ABC
PCR具有很强的放大能力，其可以定量地检 测DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特异 性，因此，将与抗原结合的特异抗体通过连接 分子与DNA结合，再经PCR扩增，由此定量检 测抗原使敏感性生物高素亲于与素E系L统I有S关A技和术课R件 IA。
免疫-PCR
一、主要程序
1. 抗原+生物素化抗体→抗原-生物素化抗 体复合物；
+ABC
ABC法在夹心ELISA中的应用 生物素亲与素系统有关技术课件
三、 生物素-亲和素系统的应用
1、BAS在酶免疫技术中的应用 2、BAS在荧光免疫技术中的应用 3、BAS在放射免疫技术中的应用 4、 BAS在分子生物学中的应用
生物素亲与素系统有关技术课件
免疫-PCR
免疫PCR是在ELISA的基础上建立起来的新方 法，用PCR扩增代替ELISA的酶催化底物显色。
但每个蛋白质上标记的生物素分子数量 应控制在一定范围。
每个抗原标记1-3个生物素分子为宜； 每个抗体标记3-5个生物素分子为宜； 生物素：Ig生G物素(亲m与g素系/m统有g关)技=术2课:件1，效果较好。
一、生物素-亲和素系统（BAS）
一) 生物素及活化生物素 二) 亲和素及链霉亲和素 三) 生物素-亲和素系统的特点
生物素亲与素系统有关技术课件
1.特异三性）强生：物素-亲和素系统的特点
亲和素和生物素间的高亲和力。
2.灵敏度高：
每个亲和素分子可与四个生物素结合； 生物素化大分子具多价性。
3.快速、稳定： 4.应用广泛：
可与酶、荧光素、胶体金等多类标记技术结合；
生物素亲与素系统有关技术课件
二、 BAS的基本类型及原理
生物素亲与素系统有关技术课件
A Monoclonal-AntibodyEnzymeImmunoassayfor Detection of HepatitisB Surface Antigen with Use of a Biotin-AvidinCSLyINstIeCmAL CHEMISTRY, 1985,31(2):202-
2.分子量：65 000 3.结构：由4个相同的肽链组成，甘氨酸和丙
氨酸含量较大 。
生物素亲与素系统有关技术课件
4.特性：1个亲和素分子可结合4个生物素分 子。
5.亲和常数：1018/mol 6.优点：为弱酸性蛋白（PI=6.0），不含糖基，
因此与聚苯乙稀的非特异性吸附远低于亲 和素，因此应用广泛。
生物素亲与素系统有关技术课件
二）亲和素和链霉亲和素
(一) 亲和素(avidin，A)
1.概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳 水化物的碱性糖蛋白。
2.分子量：68 000 3.结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白，
富含色氨酸，它是与生物素结合的基团。
生物素亲与素系统有关技术课件
4.特性：每个亚基都可结合1个生物素分子， 即1个亲和素分子可结合4个生物素分子。
PCR产物每轮循环增加一倍
30轮循环
扩增量达230个拷贝（109拷贝）
生物素亲与素系统有关技术课件
二、免疫PCR的发展
免疫PCR技术目前尚处于研究阶段，应 用的还不多；
实验表明免疫PCR的敏感性比ELISA高 105倍，且PCR产生的背景信号很弱，可 以检测到几百个分子的抗原，在理论上 免疫PCR可以检测到一个分子抗原，因 此，免疫PCR特别适用于检测一些含量 特别少亲与素系统有关技术课件
1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺 酯（BNHS）、长臂活化生物素 （BCNHS）。
2.标记蛋白质醛基：酰肼（BHZ）和肼 化生物胞素（BCHZ）。
3.标记蛋白质巯基：3-（N-马来酰亚胺丙酰）-生物胞素（MPB）。
生物素亲与素系统有关技术课件
可有Ag与Ab反应的各种免疫方法：夹 心法、间接法、竞争法等，在此基础上 引入A-B系统。 BAB法： BA法： ABC法：
生物素亲与素系统有关技术课件
1 BAB法： Ab·B A Ab·B-A B·☼ Ab·B-A-
B·☼
特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E；
Ab·B和A-B的两次放大效应，可提高灵
2. 加亲合素→抗原-生物素化抗体-亲合素 复合物；
3. 加生物素化DNA→抗原-生物素化抗体亲合素-生物素化DNA；
4. PCR扩增生物素化DNA部分。
生物素亲与素系统有关技术课件
引物
5’
3’
3’
5’
变性、退火
延伸
变性、退火
延伸
PCR扩增原理 生物素亲与素系统有关技术课件
PCR技术具有高度的灵敏性
5.亲和常数：1015/mol 6.缺点：由于是碱性蛋白（PI=10），且含
糖基，与聚苯乙烯的非特异性吸附较高， 会导致本底增大，降低检测灵敏度。
A
生物素亲与素系统有关技术课件
二）亲和素和链霉亲和素
(二)链霉亲和素(streptavidin，SA) ：
1.概念：是从链球菌属的菌培养液中提取的一 种蛋白质。
205 Definition of Three Serotypes of Hantaviruses by a Double Sandwich ELISA with Biotin-Avidin Amplification System
J. gen. Virol. 1985, 66, 1733-1740.
双抗体夹心生物素．亲和素ELISA法检测相思子毒素
免疫学杂志,2007,23(5):571-574
生物素亲与素系统有关技术课件
我是亲和素，我来了
生物素亲与素系统有关技术课件
1）生物素分子较小，与蛋白质结合后，由于
大分(二子)蛋活白化质生的物空素间位阻效应，可影响生物素
与亲和素间的结合； 2）生物素只能依靠肽键与蛋白质上的氨基结
合。 因此，活化生物素可克服以上缺点，既减少
空间位阻效应，又可扩大其结合的对象。
生物素亲与素系统有关技术课件
1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺
酯（BNHS）、长臂活化抗生体中物性素和偏碱性
（BCNHS）。
蛋白的标记
生物素亲与素系统有关技术课件
2.标记蛋白质醛基：生物素酰肼 （BHZ）、肼化生物胞素（用B于C偏H酸Z）性糖蛋
白的生物素标记
生物素亲与素系统有关技术课件
(三)生物素标记蛋白质
标记对象： 大分子活性物质：如抗原、抗体。标记 后不影响免疫活性。 酶：如HRP、葡萄糖氧化酶和ALP等。 会降低ALP的活性。
生物素亲与素系统有关技术 课件
生物素亲与素系统有关技术课件
主要内容
生物素-亲和素系统简单介绍
了解
BAS基本类型和反应原理 对不起，哥是重点！ 生物素和亲和素放大系统的应用
了解
生物素亲与素系统有关技术课件
一、生物素-亲和素系统（BAS）
一) 生物素及活化生物素 二) 亲和素及链霉亲和素 三) 生物素-亲和素系统的特点
SA
生物素亲与素系统有关技术课件
二）亲和素和链霉亲和素
(三 ) 亲和素的标记
标记对象： 大分子物质：如酶、抗原和抗体。 小分子物质：胶体金、FITC和化学发
光物等。
生物素亲与素系统有关技术课件
一、生物素-亲和素系统（BAS）
一) 生物素及活化生物素 二) 亲和素及链霉亲和素 三) 生物素-亲和素系统的特点
敏度。
生物素亲与素系统有关技术课件
+A ++A
BAB法在夹心ELISA中的应用
生物素亲与素系统有关技术课件
2 BA法：
Ab·B A·☼ Ab·B-A·☼
特点：省略加标记生物素步骤，操作较 BAB法简便；Ab·B的放大效应，该法 有相当高的灵敏度。
生物素亲与素系统有关技术课件
BA法在间接ELISA中的应用
噻吩环 （CH2）4COOH
why
why
为什么 要对生物素 进行活化？
为什么 要对生物素 进行活化？
why
生物素亲与素系统有关技术课件
我
可
以
我
是
是
抗
生
体，
物
也
素
可
以
是
酶
生物素亲与素系统有关技术课件
我是亲和素，我来了
生物素亲与素系统有关技术课件
Broken Heart
生物素亲与素系统有关技术课件