人基质金属蛋白酶9－pex基因慢病毒载体的构建

人基质金属蛋白酶９－ＰＥＸ基因慢病毒
载体的构建
赵中松，吴龙奇
（山东省交通医院，济南２５００３１）
摘要：目的　构建人基质金属蛋白酶９（ＭＭＰ－９）－ＰＥＸ基因慢病毒载体。

方法　经ＲＴ－ＰＣＲ、基因重组等技术构建包含ＭＭＰ－９－ＰＥＸ、ＭＭＰ－９信号肽的慢病毒表达载体ｐＢＰＬＶ－ｓＰＥＸ９，利用慢病毒四质粒包装系统、脂质体法共转染２９３ＦＴ细胞，包装出重组慢病毒。

根据表达载体ｐＢＰＬＶ携带ｓｉｇｎａｌ－ＰＥＸ９基因与否，分为空载体组和ＰＥＸ组。

慢病毒感染２９３ＦＴ细胞后，荧光显微镜下观察两组慢病毒载体绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）发光情况、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ法验证ＭＭＰ－９－ＰＥＸ在２９３ＦＴ细胞上清中的表达。

结果　构建的ｐｃＤＮＡ３．１－ｓＰＥＸ９重组质粒（６６９ｂｐ）测序鉴定结果与
ＧｅｎＢａｎｋ序列完全一致，说明质粒构建成功。

ｓＰＥＸ９片段与ｐＢＰＬＶ连接重组质粒双酶切，凝胶电泳可见约１２８４ｂｐ的酶切片段，与预期理论值相符，说明慢病毒表达载体ｐＢＰＬＶ－ｓＰＥＸ９构建成功。

空载体组和ＰＥＸ组转染２９３ＦＴ细胞７２ｈ，均可见较强绿色荧光，并有大量合胞体出现，说明包装慢病毒成功；多次传代培养后，仍可见很强绿色荧光，提示ＭＭＰ－９－ＰＥＸ基因已稳定整合入２９３ＦＴ细胞基因组内。

ＰＥＸ组２９３ＦＴ细胞上清液检测到２８ｋＤ蛋白条带，与预计ＰＥＸ分泌型蛋白分子量符合，空载体组未发现相应条带。

结论　本研究成功构建了携带人ＭＭＰ－９－ＰＥＸ基因的慢病毒，并将ＭＭＰ－９－ＰＥＸ基因高效导入了靶细胞，使之成功分泌出ＰＥＸ蛋白。

关键词：基质金属蛋白酶；基质金属蛋白酶９－ＰＥＸ基因；基质金属蛋白酶９信号肽；慢病毒载体
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－２６６Ｘ．２０１５．４０．０１３
中图分类号：Ｒ７３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１５）４０－００３７－０３
肿瘤的生长、浸润及转移离不开血管生成及细胞外基质（ＥＣＭ）的降解，基质金属蛋白酶（ＭＭＰｓ）作为降解ＥＣＭ的主要酶类，与肿瘤侵袭、转移密切相关［１～３］。

大多数ＭＭＰｓＣ端含有一个血红素结合蛋白样结构域（ＰＥＸ），可以调节ＭＭＰｓ的活性，抑制
ＭＭＰｓ降解ＥＣＭ及肿瘤血管生成，诱导肿瘤细胞凋亡［３～５］。

ＭＭＰ－９的信号肽可高效介导异种蛋白表达［６，７］。

２００９～２０１０年，本研究构建了人ＭＭＰ－９－ＰＥＸ慢病毒载体并获取分泌型ＭＭＰ－９－ＰＥＸ蛋白。

现报告如下。

１　材料与方法
１．１　材料　２９３ＦＴ细胞、ＨＴ１０８０细胞，中国科学院上海细胞生物研究所；慢病毒四质粒（ｐＢＰＬＶ、ｐＬＰ１、ｐＬＰ２、ｐＬＰ／ＶＳＶＧ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００脂质体，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＤＭＥＭ培养基、ＦＢＳ、高纯度质粒提取试剂盒，Ｇｉｂｃｏ公司；Ｔ４连接酶、限制性内切酶，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司；质粒ｐｃＤＮＡ３．１、Ｅ．ＣｏｌｉＤＨ５α感受态细胞，北京全式金生物技术有限公司；抗Ｈｉｓ抗体，北京中衫金桥生物技术有限公司。

ＴＲＩｚｏｌ总ＲＮＡ提取试剂、ＰＣＲ产物纯化试剂盒，上海华瞬生物技术有限公司；琼脂凝胶回收试剂盒、ＰＣＲ产物纯化试剂盒，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ公司。

引物合成与测序均由北京博迈德科技发展有限公司完成。

其他生化试剂均为国产分析纯。

１．２　ｐｃＤＮＡ３．１－ｓＰＥＸ９质粒构建及鉴定　ｐｃＤＮＡ３．１－ｓＰＥＸ９是以ｐｃＤＮＡ３．１质粒作为载体，ＭＭＰ－９－ＰＥＸ基因片段的Ｎ端融合ＭＭＰ－９信号肽，Ｃ端融合６×Ｈｉｓ抗原标签序列而成。

ＭＭＰ－９－ＰＥＸ上游引物为：５′－ＣＧ－ＧＡＡＴＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣ－３′，下游引物为：５′－ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧ－ＧＴＣＣＴＣＡＧＧＧＣＡＣＴＧＣＡＧ－３′。

依据人ＭＭＰ－９－ＰＥＸ的编码序列设计带有酶切位点ＥｃｏＲⅠ和ＸｈｏⅠ以及Ｃ端融合６×Ｈｉｓ基因的引物。

从ＨＴ１０８０细胞中提取总ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ获得ＭＭＰ－９－ＰＥＸ基因片段。

ＭＭＰ－９－ｓｉｇｎａｌ是由人工合成的上下游单链ＤＮＡ，经过退火粘连成双链，其５′端和３′端分别带有ＮｈｅⅠ和ＥｃｏＲⅠ酶切位点的黏性末端。

上游引物为：５′－ＡＴ－ＧＡＧＣＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧ－ＣＴＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＧＣＴ－３′，下游引物为：５′－ＡＧ－ＣＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣ－ＡＧＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴＣＡＴ－３′。

首先对ｐｃＤＮＡ３．１质粒进行ＮｈｅⅠ、ＥｃｏＲⅠ双酶切，过柱纯化回收，与ＭＭＰ－９－ｓｉｇｎａｌ片段过夜连接，连接产物转化Ｅ．ＣｏｌｉＤＨ５α感受态细胞；氨苄筛选阳性重组子，扩增培养，
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提取ｐｃＤＮＡ３．１－ｓｉｇｎａｌ重组质粒，进行测序鉴定正确。

ｐｃＤＮＡ３．１－ｓｉｇｎａｌ重组质粒再用ＥｃｏＲⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切，过柱纯化回收，与ＰＣＲ法扩增获得的人ＭＭＰ－９－ＰＥＸ片段用Ｔ４连接酶过夜连接，转化到Ｅ．ＣｏｌｉＤＨ５α感受态细胞；用氨苄筛选阳性克隆，提取重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１－ｓＰＥＸ９，进行酶切与测序鉴定。

依据ＧｅｎＢａｎｋ中人ＭＭＰ－９信号肽、ＭＭＰ－９－ＰＥＸ的基因序列，设计出ｓｉｇｎａｌ－ＰＥＸ９融合基因，大小为６６９ｂｐ。

１．３　慢病毒ｐＢＰＬＶ－ｓＰＥＸ９载体构建　慢病毒表达载体ｐＢＰＬＶ用ＮｈｅⅠ和ＳａｌⅠ双酶切，凝胶回收试剂盒回收；ｐｃＤＮＡ３．１－ｓＰＥＸ９用ＮｈｅⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切，凝胶回收ｓｉｇｎａｌ－ＰＥＸ９目的片段，经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接过夜，随后转化Ｅ．ＣｏｌｉＤＨ５ａ感受态细胞。

挑取阳性单克隆菌落，进行扩增培养，提取重组质粒，进行酶切鉴定，得到正确的ｐＢＰＬＶ－ｓＰＥＸ９。

１．４　慢病毒包装　依据Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司提供的慢病毒包装方法，采用慢病毒四质粒包装系统进行慢病毒包装。

根据表达载体ｐＢＰＬＶ携带ｓｉｇｎａｌ－ＰＥＸ９基因与否，分为空载体组和ＰＥＸ组。

在Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００介导下，将空载体组质粒（ｐＬＰ１、ｐＬＰ２、ｐＬＰ／ＶＳＶＧ、ｐＢＰＬＶ）和ＰＥＸ组质粒（ｐＬＰ１、ｐＬＰ２、ｐＬＰ／ＶＳＶＧ、ｐＢＰＬＶ－ｓＰＥＸ９）分别共转染生长融合至９０％左右的２９３ＦＴ细胞。

培养７２ｈ，利用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）发光情况。

１．５　ｓＰＥＸ９蛋白表达检测　将空载体组及ＰＥＸ组慢病毒感染后的２９３ＦＴ细胞培养至约８０％融合时，换成无血清ＤＭＥＭ培养基继续培养４８ｈ，收集细胞上清液，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳，转印至硝酸纤维素膜上，经５％脱脂奶粉室温下封闭１ｈ，Ⅰ抗鼠抗人Ｈｉｓ抗体（ＰＥＸ蛋白的Ｃ端携带有Ｈｉｓ抗原标签），Ⅱ抗羊抗鼠ＩｇＧ抗体在室温下孵育、显色，采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ法进行检测。

２　结果
２．１　ｐｃＤＮＡ３．１－ｓＰＥＸ９质粒鉴定　ｐｃＤＮＡ３．１－ｓＰＥＸ９重组质粒转化Ｅ．ＣｏｌｉＤＨ５α感受态细胞进行扩增后，得到６６９ｂｐ大小的片段质粒，测序鉴定结果与Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ序列完全一致，记为ｐｃＤＮＡ３．１－ｓＰＥＸ９。

见图１。

２．２　慢病毒ｐＢＰＬＶ－ｓＰＥＸ９的构建及鉴定　对质粒ｐｃＤＮＡ３．１－ｓＰＥＸ及ｐＢＰＬＶ分别酶切后，凝胶电泳见约１２８４ｂｐ酶切片段，与预期理论值相符，证明ｐＢ－ＰＬＶ－ｓＰＥＸ９重组慢病毒表达载体构建成功。

见图２。

２．３　慢病毒包装　ｐＢＰＬＶ及ｐＢＰＬＶ－ｓＰＥＸ９慢病毒质粒均携带ＧＦＰ发光基因，慢病毒包装四质粒共同转染２９３ＦＴ细胞７２ｈ，空载体组和ＰＥＸ组均可见较强绿色荧光，并有大量合胞体出现
，说明包装慢病毒
注：１为ＤＬ２０００ｐｌｕｓＤＮＡＭａｒｋｅｒ；２为ｐｃＤＮＡ３．１－ｓＰＥＸ９质粒。

图１　ｐｃＤＮＡ３．１－
ｓＰＥＸ９质粒酶切鉴定
注：１为ＢＭ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；２为ｐＢＰＬＶ－ｓＰＥＸ９慢病毒质粒。

图２　ｐＢＰＬＶ－ｓＰＥＸ９慢病毒载体酶切鉴定
成功。

见插页Ⅰ图３。

２．４　两组感染２９３ＦＴ细胞４８ｈＧＦＰ表达情况　两组均可见９０％以上２９３ＦＴ细胞有ＧＦＰ表达，多次传代培养后，仍可见很强的绿色荧光。

提示ＭＭＰ－９－
ＰＥＸ已稳定整合入２９３ＦＴ细胞基因组内。

见插页Ⅰ图４。

２．５　两组ＰＥＸ蛋白表达　ＰＥＸ组２９３ＦＴ细胞上清液检测到２８ｋＤ蛋白条带，与预计ＰＥＸ分泌型蛋白分子量符合，空载体组未发现相应条带。

见图
３。

注：１为空载体组；２为ＰＥＸ组。

图３　两组ＰＥＸ蛋白表达电泳图
３　讨论
ＭＭＰｓ是由多种锌离子依赖性酶组成的、降解ＥＣＭ的重要酶类，在肿瘤血管生成、肿瘤侵袭及相关炎症反应中发挥重要作用［８，９］，近年来逐渐成为肿瘤
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治疗研究的热点。

ＰＥＸ是除ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－２３、ＭＭＰ－２６以外，所有ＭＭＰｓ的Ｃ端都具有的一个血红素蛋白样结构域。

ＰＥＸ作为ＭＭＰｓ的内源性抑制剂，可抑制ＭＭＰｓ的活性，进而阻止肿瘤血管生成、侵袭及转移。

黄炜等［１０］通过ＰＥＸ重组质粒转染胶质瘤干细胞显示，ＰＥＸ对体外培养的胶质瘤干细胞增殖有明显抑制作用。

屈洪涛等［１１］研究认为，ＭＭＰ－２－ＰＥＸ和
ＭＭＰ－２与垂体腺瘤的侵袭行为存在一定的平衡关系，其激活和抑制机制彼此联系，ＭＭＰ－２－ＰＥＸ低表达及ＭＭＰ－２高表达可能预示垂体腺瘤更具有侵袭性。

Ｂｕｒｇ－Ｒｏｄｅｒｆｅｌｄ等［１２］证实，ＰＥＸ蛋白可以抑制结肠癌细胞的黏附。

Ｅｚｈｉｌａｒａｓａｎ等［１３］研究证实，ＰＥＸ蛋白可降低ＭＭＰｓ的活性，诱导胶质瘤细胞及内皮细胞的凋亡，从而抑制肿瘤血管形成及侵袭。

当ＰＥＸ蛋白与低剂量化疗药物联合使用时，可长期抑制胶质瘤动物模型生长，并无明显耐药性［１４］。

因此，ＰＥＸ基因疗法具有良好的抗肿瘤应用前景。

ＭＭＰ－２和ＭＭＰ－９是降解ＥＣＭ成分最主要的两种ＭＭＰｓ，有关ＭＭＰ－２－ＰＥＸ基因疗法研究较多，但ＭＭＰ－９－ＰＥＸ鲜有报道。

本研究中为获得有活性的ＭＭＰ－９－ＰＥＸ蛋白，首先构建了一个稳定的真核表达系统。

ＰＥＸ主要通过位于细胞表面的整合素来调节ＭＭＰｓ活性。

多项研究证实，ＭＭＰ－９的信号肽可以高效诱导重组蛋白在真核细胞中分泌及表达［６，７］。

因此，本研究选择ＭＭＰ－９信号肽用于引导ＭＭＰ－９－ＰＥＸ分泌至细胞外，以发挥其调节作用。

近年来，慢病毒作为基因转移载体逐渐受到重视，其可感染分裂期及非分裂期细胞，转染效率高、稳定性好、安全性高，是目前较理想的基因转移载体［１５］。

本研究采用慢病毒介导法来获得ＭＭＰ－９－ＰＥＸ的真核表达系统。

采用基因重组技术逐步将ＭＭＰ－９信号肽、ＭＭＰ－９－ＰＥＸ基因插入到质粒ｐｃＤ－ＮＡ３．１，成功构建出ｐｃＤＮＡ３．１－ｓＰＥＸ９重组质粒，从中获取ｓＰＥＸ９基因片段，再连接入慢病毒表达质粒ｐＢＰＬＶ，构建ｐＢＰＬＶ－ｓＰＥＸ９重组质粒。

因为ｐＢＰＬＶ带有ＧＦＰ发光基因，当第３代慢病毒四质粒共转染２９３ＦＴ细胞后，可通过荧光显微镜观察荧光强度，评估病毒的包装情况。

本研究结果显示，几乎所有２９３ＦＴ细胞都表达ＧＦＰ，并可见大量合胞体出现，说明慢病毒包装成功，包装效率较高。

慢病毒感染２９３ＦＴ细胞后，９０％以上细胞可表达ＧＦＰ，多次传代培养仍见很强绿色荧光，表明目的基因ｓＰＥＸ９已经稳定整合入２９３ＦＴ细胞基因组内。

对感染细胞进行无血清培养，取上清采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ法进行蛋白检测，结果显示ＭＭＰ－９－ＰＥＸ蛋白在２９３ＦＴ细胞内表达并在细胞外分泌。

总之，本研究成功构建了携带人ＭＭＰ－９－ＰＥＸ基因的慢病毒载体，并将ＭＭＰ－９－ＰＥＸ基因高效导入靶细胞，成功分泌出ＰＥＸ蛋白。

该体系的构建为更深入地研究ＰＥＸ的作用提供了实验基础。

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