细胞培养技术实用篇
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细胞生物学技术
2020/8/16
第三章 细胞培养基本技术
动脉粥样硬化研究所
局限性
2020/8/16
人工模拟的条件和体内实际情况仍不完全相同 缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和
细胞相互间的影响 体外培养的细胞生活在缺乏动态平衡的环境环
境中，必然发生变化。
本章主要内容
2020/8/16
细胞培养的基本操作技术 原代培养(primary culture) 传代培养(subculture) 体外培养细胞的影响因素 细胞培养污染及对策 培养细胞的生长测定方法 细胞冻存和复苏
细胞培养(Cell Culture)： 培养物是单个细胞 和细胞群。
细胞培养中的常用术语
2020/8/16
原代培养（primary culture）：从体内取出细 胞或组织的第一次培养。
传代（passage）也称再培养。无论是否稀释， 将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶 即称为传代或传代培养。也称再培养。
组织材料的分离
2020/8/16
机械法：适于较柔软的组织，如脑、脾、淋巴结、 胸腺等。剪切组织为1mm3碎块后，置于组织匀浆 器研磨或用注射器针芯挤压后过不锈钢筛网。
化学法：胰蛋白酶、胶原酶、EDTA法 细胞悬液的分离方法：低速离心法、密度梯度离
心法
细胞悬液的分离方法
2020/8/16
低速离心法： 血液和体液等细胞悬液5001000rpm离心5-10min。离心速度过大、时间过 长，会造成细胞损伤和死亡。
一些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架 等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。
洗手和着装
2020/8/16
原则上和外科手术相同。 仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外
线照射30min的清洁工作服 在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着
长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消 毒手。 进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。 专用鞋或带鞋套
用火焰烧灼消毒或取备品更换。
2020/8/16
组织细胞取材及培养的基本要求
取材的组织用培养液浸泡，4℃运送，24h内尽快培养。 取材时应严格无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量
去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链 霉素和制霉菌素漂洗。 原代培养，特别是正常细胞的培养，应采用营养丰富的 培养液。 一般来讲,胚胎组织较成熟个体的组织容易培养;分化低 的较分化高的组织容易生长;肿瘤组织较正常组织容易 培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。 为了便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体外培养 与原组织的差异性，原代取材同时保留组织学和电镜标 本，对供体来源、部位及一般情况做记录。
肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。 而对含结缔组织较丰富的组织，如乳腺、滑膜、 子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等无效．但若与胶原 酶合用能增加其对组织的分离作用 。 钙镁离子和血清抑制其活性。 常用剂量为0.25%，PH8，温度37℃
2020/8/16
胶原酶法（COLLAGENASE）
水解结缔组织中胶原蛋白成分，对上皮细胞影 响不大。
密度梯度离心法： 用离心法将细胞分到不同 密度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。适 于分离密度不等的细胞。常用介质有Ficoll 400，Percoll，泛影葡胺等。
2020/8/16
胰蛋白酶（TRYPSIN）
对细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。 消化效果与PH值、温度、酶浓度和组织块大小与
硬度有关。 适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离
细胞培养中的常用术语
2020/8/16
组织培养(Tissue Culture)： 指的是从体内取 出组织，模拟体内生理环境，使之生存和生长并 维持其结构和功能的方法。
器官培养（Organ Culture）： 培养的是器官的 原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生 存、生长和保持一定功能的方法。
产品有Ⅳ Ⅶ Ⅸ等型，分别适用于分离肝细胞、 胰岛、脂肪细胞及纤维组织。
钙镁离子和血清不影响活性，PH6.5-7 常用剂量为200U/ml
2020/8/16
Байду номын сангаас
EDTA法
2020/8/16
▪ EDTA能与细胞上的钙、镁离子结合形成整合 物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细 胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。
火焰消毒
2020/8/16
在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先 要点燃酒精灯。
按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近 处并经过烧灼进行。
如实验用品需火焰灭菌，冷却后接触培养细胞， 以防烧死细胞。
操作
2020/8/16
进行培养时，动作要准确敏捷 不能太快，否则空气流动增加污染机会。 不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要
细胞系（cell line）：原代培养物经首次传代 成功后即为细胞系
细胞培养中的常用术语
2020/8/16
细胞株（cell strain）：通过选择法或克隆形成法 从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标 志的培养物称细胞株。
汇合（confluent）：细胞相互连接成片占据所有底 物面积。
▪ 缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时 呈片状，有团块，常不单独使用，可与胰蛋白 酶混合使用(1：1或2：1)，既利于细胞脱壁又 利于细胞分散。可降低胰酶的用量和毒性作用。
接触抑制（contact inhibition）：细胞汇合相互 接触后失去运动的现象
2020/8/16
一、细胞培养基本操作技术
由于体外培养的 细胞没有抗感染能力， 因此防污染是决定培 养成功的首要条件。 一切操作需要保证 无菌和有条不紊。
培养前准备
2020/8/16
制定好实验计划和操作程序 有关数据的计算要事先做好。 准备各种所需器材和物品，清点无误后将其放置
在操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。 避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污
染机会。
消毒
2020/8/16
地面每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布 要专用)，紫外线照射消毒30-50min
超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然 后紫外线消毒30min。
消毒时工作台面上用品布局合理，不要过多或重叠 放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。
2020/8/16
第三章 细胞培养基本技术
动脉粥样硬化研究所
局限性
2020/8/16
人工模拟的条件和体内实际情况仍不完全相同 缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和
细胞相互间的影响 体外培养的细胞生活在缺乏动态平衡的环境环
境中，必然发生变化。
本章主要内容
2020/8/16
细胞培养的基本操作技术 原代培养(primary culture) 传代培养(subculture) 体外培养细胞的影响因素 细胞培养污染及对策 培养细胞的生长测定方法 细胞冻存和复苏
细胞培养(Cell Culture)： 培养物是单个细胞 和细胞群。
细胞培养中的常用术语
2020/8/16
原代培养（primary culture）：从体内取出细 胞或组织的第一次培养。
传代（passage）也称再培养。无论是否稀释， 将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶 即称为传代或传代培养。也称再培养。
组织材料的分离
2020/8/16
机械法：适于较柔软的组织，如脑、脾、淋巴结、 胸腺等。剪切组织为1mm3碎块后，置于组织匀浆 器研磨或用注射器针芯挤压后过不锈钢筛网。
化学法：胰蛋白酶、胶原酶、EDTA法 细胞悬液的分离方法：低速离心法、密度梯度离
心法
细胞悬液的分离方法
2020/8/16
低速离心法： 血液和体液等细胞悬液5001000rpm离心5-10min。离心速度过大、时间过 长，会造成细胞损伤和死亡。
一些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架 等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。
洗手和着装
2020/8/16
原则上和外科手术相同。 仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外
线照射30min的清洁工作服 在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着
长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消 毒手。 进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。 专用鞋或带鞋套
用火焰烧灼消毒或取备品更换。
2020/8/16
组织细胞取材及培养的基本要求
取材的组织用培养液浸泡，4℃运送，24h内尽快培养。 取材时应严格无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量
去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链 霉素和制霉菌素漂洗。 原代培养，特别是正常细胞的培养，应采用营养丰富的 培养液。 一般来讲,胚胎组织较成熟个体的组织容易培养;分化低 的较分化高的组织容易生长;肿瘤组织较正常组织容易 培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。 为了便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体外培养 与原组织的差异性，原代取材同时保留组织学和电镜标 本，对供体来源、部位及一般情况做记录。
肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。 而对含结缔组织较丰富的组织，如乳腺、滑膜、 子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等无效．但若与胶原 酶合用能增加其对组织的分离作用 。 钙镁离子和血清抑制其活性。 常用剂量为0.25%，PH8，温度37℃
2020/8/16
胶原酶法（COLLAGENASE）
水解结缔组织中胶原蛋白成分，对上皮细胞影 响不大。
密度梯度离心法： 用离心法将细胞分到不同 密度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。适 于分离密度不等的细胞。常用介质有Ficoll 400，Percoll，泛影葡胺等。
2020/8/16
胰蛋白酶（TRYPSIN）
对细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。 消化效果与PH值、温度、酶浓度和组织块大小与
硬度有关。 适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离
细胞培养中的常用术语
2020/8/16
组织培养(Tissue Culture)： 指的是从体内取 出组织，模拟体内生理环境，使之生存和生长并 维持其结构和功能的方法。
器官培养（Organ Culture）： 培养的是器官的 原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生 存、生长和保持一定功能的方法。
产品有Ⅳ Ⅶ Ⅸ等型，分别适用于分离肝细胞、 胰岛、脂肪细胞及纤维组织。
钙镁离子和血清不影响活性，PH6.5-7 常用剂量为200U/ml
2020/8/16
Байду номын сангаас
EDTA法
2020/8/16
▪ EDTA能与细胞上的钙、镁离子结合形成整合 物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细 胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。
火焰消毒
2020/8/16
在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先 要点燃酒精灯。
按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近 处并经过烧灼进行。
如实验用品需火焰灭菌，冷却后接触培养细胞， 以防烧死细胞。
操作
2020/8/16
进行培养时，动作要准确敏捷 不能太快，否则空气流动增加污染机会。 不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要
细胞系（cell line）：原代培养物经首次传代 成功后即为细胞系
细胞培养中的常用术语
2020/8/16
细胞株（cell strain）：通过选择法或克隆形成法 从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标 志的培养物称细胞株。
汇合（confluent）：细胞相互连接成片占据所有底 物面积。
▪ 缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时 呈片状，有团块，常不单独使用，可与胰蛋白 酶混合使用(1：1或2：1)，既利于细胞脱壁又 利于细胞分散。可降低胰酶的用量和毒性作用。
接触抑制（contact inhibition）：细胞汇合相互 接触后失去运动的现象
2020/8/16
一、细胞培养基本操作技术
由于体外培养的 细胞没有抗感染能力， 因此防污染是决定培 养成功的首要条件。 一切操作需要保证 无菌和有条不紊。
培养前准备
2020/8/16
制定好实验计划和操作程序 有关数据的计算要事先做好。 准备各种所需器材和物品，清点无误后将其放置
在操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。 避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污
染机会。
消毒
2020/8/16
地面每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布 要专用)，紫外线照射消毒30-50min
超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然 后紫外线消毒30min。
消毒时工作台面上用品布局合理，不要过多或重叠 放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。