荧光分析法综述

1摘要
2概述
荧光分析法的发展
荧光分析法的发展，与仪器应用的发展是分不开的。

19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West研制出第一台光电荧光计。

早期的光电荧光计的灵敏度是有限的，1939年Zworykin和Rajchman发明光电倍增管以后，在增加灵敏度和容许使用分辨率更高的单色器等方面，是一个非常重要的阶段。

1943年Dutton和Bailey 提出了一种荧光光谱的手工校正步骤，1948年由Studer推出了第一台自动光谱校正装置，
到1952年才出现商品化的校正光谱仪器。

近十几年来，在其他学科迅速发展的影响下，激光、微处理机、电子学、光导纤维和纳米材料等方面的一些新技术的引入，大大推动了荧光分析法在理论和应用方面的进展，促进了诸如同步荧光测定、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定、荧光偏振测定、荧光免疫测定、低温荧光测定、固体表面荧光测定、近红外荧光分析法、荧光反应速率法、三维荧光光谱技术、荧光显微与成像技术、空间分辨荧光技术、荧光探针技术、单分子荧光检测技术和荧光光纤化学传感器等荧光分析方面的某些新方法、新技术的发展，并且相应地加速了各式各样新型的荧光分析仪器的问世，使荧光分析法不断朝着高效、痕量、微观、实时、原位和自动化的方向发展，方法的灵敏度、准确度和选择性日益提高，方法的应用范围大大扩展，遍及工业、农业、生命科学、环境科学、材料科学、食品科学和公安情报等诸多领域。

如今，荧光分析法已经发展成为一种十分重要且有效的光谱化学分析手段，并不断地有介绍其新方法、新技术、新应用和研究进展的专著出版。

在我国，20世纪50年代初期仅有极少数的分析化学工作者从事荧光分析方面的工作，但到了70年代后期，荧光分析法已引起国内分析界的广泛重视，在全国众多的分析化学工作者中，已逐步形成一支从事这一领域工作的队伍。

而且，在除分析学科意外的其他科学领域里，应用荧光光谱法作为研究手段的也日益增多。

近年来，国内发表的有关荧光分析方面的论文数量增长很快，所涉及的内容页已从经典的荧光分析法逐步扩展到新近发展起来的一些新方法和新技术。

在仪器应用方面，也陆续有几种类型的国产的商品化荧光分光光度计问世，为这一分析方法的发展和普及提供了一定的物质条件。

有了上述的基础，相信在今后一段时间内，在我国社会发展需要的推动下和广大分析化学工作者的共同努力下，荧光分析法必将在我国得到更迅速的发展。

荧光分析法的概述
荧光分析法的原理
荧光分析法的特点
荧光分析法的应用
一、基本原理
某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluorescence analysis）。

荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。

在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到
光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。

跃迁到较高能级的分子，很快（约10-8s）因碰撞而以热的形式损失部分能量，由所处的激发态能级下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。

由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。

荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。

物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。

如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（excitation spectrum）。

实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。

在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。

在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。

激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。

对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。

二、荧光仪的主要部件
测定荧光可用荧光计和荧光分光光度计，二者的结构复杂程度不同，但其基本结构是相似的。

由光源发出的光，经单色器让特征波长的激发光通过，照射到液槽使荧光物质发射出荧光，经第二个单色器让待测物质所产生的特征波长荧光通过，照射到检测器产生光电流，经放大后以指针指示或用记录仪记录其信号。

仪器的主要部件如下：
1．光源：发射紫外区和可见区的激发光，一般常用的为溴钨灯和供蒸汽灯，以及氙弧灯。

2．单色器：仪器共有两个单色器，作用分别是滤去非特征波长的激发光，和滤去非特征波长荧光的杂散光。

3．液槽：用来盛放待测溶液。

4．检测器：检测待测物质所发射的荧光信号。

三、荧光分析法的定性和定量
（一）定性分析
荧光物质特性的光谱包括激发光谱和荧光光谱两种。

在分光光度法中，被测物质只有一种特征的吸收光谱，而荧光分析法能测出两种特征光谱，因此，鉴定物质的可靠性较强。

当然，必须在标准品对照下进行定性。

（二）定量测定
荧光分析法的定量测定方法较多，可分为直接测定法和间接测定法
两类。

1、直接测定法：
利用荧光分析法对被分析物质进行浓度测定，最简单的便是直接测
定法。

某些物质只要本身能发荧光，只须将含这类物质的样品作适当的前处理或分离除去干扰物质，即可通过测量它的荧光强度来测定其浓度。

具体方法有两种。

（1）直接比较法：配制标准溶液的荧光强度Fx，已知标准溶液的
浓度Cs，便可求得样品中待测荧光物质的含量。

如果空白溶液的荧光强度调不到零，则必须从Fs和Fx值中扣除空白溶液的荧光强度F0，然后进行计算。

（2）标准曲线法：将已知含量的标准品经过和样品同样处理后，配成
一系列标准溶液，测定其荧光强度，以荧光强度对荧光物质含量绘制标准曲线。

再测定样品溶液的荧光强度，由标准曲线便可求出样品中待测荧光物质的含量。

为了使各次所绘制的标准曲线能重合一致，每次应以同一标准溶液对仪器进行校正。

如果该溶液在紫外光照射下不够稳定，则必须改用另一种稳定而荧光峰相近的标准溶液来进行校正。

例如，测定维生素B1时，可用硫酸奎宁溶液作为基准；测定维生素B2时，可用荧光素钠溶液作为基准来校正仪器。

2、间接测定法：
有许多物质，它们本身不能发荧光，或者荧光量子产率很低，仅能显现非常微弱的荧光，无法直接测定，这时可采用间接测定方法。

间接测定方法有以下几种：
（1）化学转化法：通过化学反应将非荧光物质变为适合于测定的荧光物质。

例如金属与螯合剂反应生成具有荧光的螯合物。

有机化合物可通过光化学反应、降解、氧化还原、偶联、缩合或酶促反应，使它们转化为荧光物质。

（2）荧光猝灭法：这种方法是利用本身不发荧光的被分析物质能使某种荧光化合物的荧光猝灭的性质，通过测量荧光化合物荧光强度的下降，间接地测定该物质的浓度。

（3）敏化发光法：对于很低浓度的分析物质，如果采用一般的荧光测定方法，其荧光信号太弱而无法检测，可使用一种物质（敏化剂）以吸收激发光，然后将激发光能传递给发荧光的分析物质，从而提高被分析物质测定的灵敏度。

上述三种方法均为相对测定方法，在实验时须采用某种标准进行比较。

四、减小测量误差的方法
（1）溶剂：溶剂能影响荧光效率，改变荧光强度，因此，在测定时必须用同一溶剂。

（2）浓度：在较浓的溶液中，荧光强度并不随溶液浓度呈正比增长。

因此，必须找出与荧光强度呈线性的浓度范围。

（3）酸度：荧光光谱和荧光效率常与溶液的酸度有关，因此，须通过条件试验，确定最适宜的pH值范围。

（4）温度：荧光强度一般随温度降低而提高，因此，有些荧光仪的液槽配有低温装置，使荧光强度增大，以提高测定的灵敏度。

在高级的荧光仪中，液槽四周有冷凝水并附有恒温装置，以便使溶液的温度在测定过程中尽可能保持恒定。

（5）时间：有些荧光化合物需要一定时间才能形成；有些荧光物质在激发光较长时间照射下会发生光分解。

因此，过早或过晚测定荧光强度均会带来误差。

必须通过条件试验确定最适宜的测定时间，使荧光强度达到量大且稳定。

为了避免光分解所引起的误差，应在荧光测定的短时间内才打开光闸其余时间均应关闭。

（6）共存干扰物质有些干扰物质能与荧光分子作用使荧光强度显著下降，这种现象称为荧光的猝灭（quenching）；有些共存物质能产生荧光或产生散射光，也会影响荧光的正确测量。

故应设法除去干扰物，并使用纯度较高的溶剂和试剂。