免疫学诊断及检测技术

现已明确支气管哮喘是以气道炎症细胞（包括嗜酸性粒细胞、肥大细胞等）浸润为主要病理特征的免疫性疾病。

在其发病过程中，免疫系统的多种成分如T细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、免疫球蛋白、细胞因子和粘附因子等起着关键的作用。

对这些成分的免疫学监测有助于阐明支气管哮喘的病因、发病过程以及对疾病严重程度的r解，并可指导支气管哮喘的治疗。

这些检测大致可分为特异性的免疫学检测和非特异性的免疫学检测两大类。

第一节特异性免疫学检测试验
特异性免疫试验主要包括体内过敏试验、体外特异性IgE抗体的检测、嗜碱性粒细胞释放能力的检测等，这些试验可以直接或间接反映引起支气管哮喘发作的过敏原、体内特异性IgE的水平。

一、体内过敏试验
主要有过敏原皮试和激发试验两种。

（一）过敏原皮试
过敏性哮喘患者产生的针对某一种或多种过敏原的IgE或IgG4与皮肤粘膜下层的肥大细胞、嗜碱性粒细胞Fe受体结合。

局部接触过敏原后，引起I型变态反应，从而使局部充血，水肿，形成风团和红晕等临床表现，故我们通过皮试来了解过敏性哮喘患者的过敏原以及机体的敏感状态和脱敏的疗效。

常用的过敏原皮试法有皮内试验、点刺法、抓痕法、斑贴法、被动皮肤转移试验法等五种，其中前两种的应用较为广泛。

皮试的部位一般采用上臂的伸侧，也可在大腿或背部。

1．皮内试验(intradermal test) 常用过敏原皮试液的浓度为1：100，对于花粉浸液则可用l1000或1:10000。

方法及步骤：酒精消毒局部皮肤后，用1ml注射器分别吸入不同过敏原的皮试液，在受试部位依次注入皮内0.02ml，使之形成一3-4mm直径的皮丘。

为避免结果互相影响，相邻皮丘间距为3cm左右。

15分钟后观察结果。

有些患者反应较迟，可在皮试后30分钟时再观察一次。

皮内试验的结果主要表现为风团和红晕，其分级判断标准参见表14-1。

皮内法结果敏感、准确、重复性较好，但由于其注入的过敏原量较多，有可能使高度敏感的病人产生过敏性哮喘或过敏性休克等全身反应，因此有一定的危险性。

此外，该试验结果的假阳性率比较高。

2点刺试验(prick test) 所用过敏原皮试液的浓度为皮内法的10 N100倍。

方法及步骤：先在皮试部位滴上一滴过敏原皮试液，然后用特制的点刺针在滴有皮试液的皮肤中央进行点刺，点刺的深度以不引起出血为度。

1分钟后擦去皮试液，15分钟后观察结果，以局部出现风团和红晕为阳性反应。

其结果分级判断标准参见表14-2：
点刺法优点：同皮内法相比，①其方法更为简单；②患者的局部疼痛比较轻；③易于为患者所接受；④进入患者体内的过敏原量比皮内法少得多，因而引起全身过敏反应的可能性小，比较安全；假阳性率也比较低。

目前，国内外皮试多采用此法。

但该法的敏感性不如皮内法，而且对皮试结果的分级不如皮内法明显。

3．划痕法( scratch test) 方法及步骤：用消毒后的粗针头在局部皮肤划痕，其深度也是以不出血为度，每一痕长为0.5cm，相邻两条痕之间间隔约3cm。

然后依次滴上过敏原皮试液或对照液，十五分钟后观察结果。

划痕部位隆起并绕以红晕者为阳性。

该法优点是不引起疼痛，尤适用于儿童。

但由于进入皮内的过敏原量难以控制，故准确性较差。

4斑贴法(patch test) 方法及步骤：在病人的前臂曲侧皮肤上滴上一滴O.lN的NaOH 溶液用来软化皮肤表面的角质层。

擦干后，将纯净的过敏原研成粉末，置于该处。

滴上生理盐水或人工汗液（其主要成份含氯化钠13‰、乳酸2‰、脂酸2‰、硫酸钠l%、尿素l%），轻轻拌匀后，覆盖一层塑料薄膜，再用纱布包扎。

24～48小时后观察结果。

以出现红晕、丘疹、水疱者为阳性反应，该试验的观察时间长，假阳性和假阴性率均比较高，因而目前已不常用于哮喘病的病因学诊断，但仍是皮肤科用于接触性变应原诊断的重要手段之一。

5．被动皮肤转移试验( passive transfer test) 该法由德国的Prallsnitz和Kustner于1921年共同发现，故又称为P-K试验。

方法及步骤：采取病人全血后，分离血清(内含特异性IgE)，然后在受试者皮内注入O.lml病人血清，并在注入处做好标记，于24～48小时后，在受试者皮肤的原血清注入处进行各种过敏原皮试。

被动皮肤转移试验适用于皮肤反应性过强（如皮肤划痕征阳性）或过弱（注射1:10000的磷酸组胺后皮肤无反应）以及皮肤广
泛病变而不能进行自身过敏原皮试的患者。

其缺点是易传播乙肝、梅毒、爱滋病等传染性疾病，故病人试验前应注意对这些传染性疾病进行检测。

随着体外检测特异性IgE技术的不断发展本法已经很少应用于临床，主要在研究时应用。

过敏原皮试同其它方法比，具有敏感性高，检测速度快，重复性好，操作简单，费用低的优点。

但是，应当认识到，支气管哮喘的靶器官是在支气管，而不是在皮肤。

因此，过敏原皮试的结果与实际上引起患者支气管哮喘发作的过敏原种类及其反应程度之间有一定的差距。

必要时，应进行过敏原气道激发试验或直接检测抗原特异性IgE。

（二）激发试验（provocation tests）
对于一些皮肤反应性过强或过弱不适合皮试，以及皮试结果与临床症状不符的病人可进一步采用激发试验。

常用的激发试验有支气管激发试验及鼻粘膜激发试验等。

1．支气管激发试验( bronchial provocation test，BPT) BPT在支气管哮喘的病因诊
断，发病机理和免疫治疗方面的研究具有重要价值。

它是通过让患者雾化吸入过敏原后观察患者有无哮喘发作及肺通气功能的变化情况，从而明确引起哮喘发作的过敏原种类以及机体对其敏感程度。

方法及步骤：试验应在哮喘缓解期进行。

试验前2～3天内停用任何有关哮喘治疗的药物（包括β2激动剂、激素、茶碱、肥大细胞膜稳定剂等）。

常用的吸入过敏原包括各种花粉、霉菌、螨、室内尘土等。

一般以10倍的梯度配制溶液系列，将过敏原稀释成浓度为1:100、1：1000、1:10000、1:100000等。

如估计在直接吸入下一浓度有可能诱发哮喘发作，则可在上述浓度系列中插入中间浓度的稀释液如l：500、1：5000等。

一般最高吸入浓度，室内尘土不超过1:10，花粉不超过1:100，霉菌不超过1:1000。

试验开始时首先测定患者的基础肺功能（FEV1或PEFR等）。

然后按照浓度从低到高的次序，分别给病人雾化吸入定量过敏原稀释液。

观察患者反应并在10分钟后复查患者肺功能指标。

当病人出现①胸部紧迫感、喘息；②肺部闻及哮鸣音；③FEV、下降大于15%时，表明该试验结果阳性，立即终止试验。

若吸入最高浓度的稀释液后仍无上述表现，结果可判为阴性。

在试验过程中应注意：①为避免支气管哮喘的严重发作，必须从最低浓度开始；②由于迟发性反应的存在，有条件者应观察24小时以上；③在进行多种过敏原的BPT时，两次激发试验应间隔足够长时间，以免影响结果。

近年来，Tamura等人提出应用单次过敏原吸入法，从而简化了BPT的测定。

该法的过敏原稀释液只有一个浓度，室内尘土为1:5，豚草为1:10，花粉为1：10，患者一次性雾化吸入过敏原稀释液一分钟后，连续测定其基础呼吸阻力(Rrs) 10分钟，若10分钟内Rrs上升超过基础值的35%，则为阳性反应。

BPT直接以支气管粘膜作为靶器官，因而，对引起支气管哮喘发作的过敏原及机体敏感状态的判断不仅直接，而且敏感、准确。

同一种待测过敏原，如果皮试结果与BPT 结果相矛盾，则以BPT试验结果为准。

但本法也存在着一些不足：①引起敏感病人支气管哮喘严重发作的危险性较大；②需要有专门的仪器和设备；③每次激发只能采用一种过敏原，因而检验效率低。

同时，我们还常看到这样的现象，有些病人对某一种过敏原的BPT呈阳性反应，但这些病人却在同样过敏原存在的场所或空间并不表现哮喘发作，或者只出现轻度的鼻部症状，即BPT试验也存在一定的假阳性率。

鉴于以上不足，BPT在
临床上的应用也受到一定的限制。

目前国外多采用“自然暴露法”以降低假阳性率。

2．眼激发试验(ophthalmic prococation test) 方法及步骤：一侧眼中滴入一滴浓度为1:1000的过敏原稀释液，另一侧滴入一滴不含过敏原的过敏原溶媒作为对照，十五分钟后观察结果。

若无反应，可在同侧眼中滴入1:100的过敏原稀释液，十五分钟后仍无反应，则依次用1:10、纯净的过敏原粉末进行试验。

其阳性反应表现为眼刺痒感、流泪、结膜充血水肿。

由于受试部位在眼睛，故我们在试验中应注意：观察后，应立即用生理盐水或3%的硼酸溶液冲洗；反应重的可滴入1—2滴肾上腺素或0.5%的醋酸可的松溶液。

眼激发试验比较简单、直观。

但过敏原稀释液、纯净的过敏原粉末对结膜的非特异性刺激作用，易出现假阳性结果。

此外，具有强刺激性的过敏原切不可采用此法。

3.鼻粘膜激发试验( nasal provocation test) 方法及步骤：用两张0.5cmx lcm大小的滤纸片浸满过敏原原液或不含过敏原的过敏原溶解液（也可直接将过敏原粉末或淀粉）分别置于两侧鼻甲的前端。

如果五到十五分钟内出现鼻痒、鼻塞、喷嚏、流涕等症状，检查可见接触过敏原侧鼻腔粘膜苍白、水肿，鼻腔中有大量浆液性分泌物，表明该试验结果阳性。

鼻粘膜激发试验的结果较为直观、可靠，其与临床相符率比皮试高，但该试验每次只能检测一种抗原，检验效率低。

二、特异性IgE抗体的检测
随着生物技术的不断发展，通过对抗原特异性IgE的检测从而明确过敏原的方法已经得到了广泛的应用。

其中包括放射性变应原吸附试验、酶联免疫吸附试验和嗜碱性粒细胞组胺释放试验等。

（一）放射性变应原吸附试验（radio allergosorbent test，RAST)
RAST于1967年，由Wide等人首次应用于血清中特异性IgE的检测。

它的原理是：将待测过敏原结合于固相聚合体（纤维素颗粒或滤纸等），聚合体上的过敏原与待测血清中特异性IgE结合，形成聚合体一过敏原．特异性IgE的复合物。

当加入用同位素标记（常用125 I）的抗IgE抗体后，进一步结合形成聚合体．过敏原特异性IgE-125 I抗IgE抗体的大复合物。

用γ-计数器测定整个大复合物的放射活性。

待测血清中的特异性IgE的浓度与大复合物的放射性成正比。

由此判断待测血清中特异性lgE的水平。

1．RAST的一般步骤①用溴化氢技术将过敏原（如花粉、屋尘、螨等）两价结合于滤纸片后，将滤纸片放入容器的底部，②用微量加样器小心将待测血清（或标准品）加在滤纸上，室温孵育至血清IgE（标准品）与过敏原充分结合后，应用磷酸缓冲液（PBS液）多次冲洗容器及滤纸片，洗去未结合的IgE；③加入125 I标记的抗人IgE，室温孵育后，再用磷酸缓冲液洗去未结合的碘标记抗人IgE抗体；④置于γ-计数器计数。

结果判断标准：一般以大于正常人平均数加两个标准差者为阳性。

2．RAST的优点①结果准确，RAST与过敏原皮试和支气管粘膜激发试验等方法的检测结果符合率高；②可同时进行多种过敏原和多个病人血清的检测；③敏感度高、特异性好；
④不受所用平喘药物的影响。

基于上述优点，多数学者认为RAST是检测血清特异性IgE 的金标准，成为抗原特异性IgE检测的首选方法。

目前已成为支气管哮喘的病因学诊断和
免疫治疗疗效的可靠指标。

3．RAST的缺点同皮试法相比，①其敏感性稍低于皮试；②易受到一些因素的干扰，如特异性IgG水平的增高可影响RAST的结果；③需要采用γ-计数器、液体闪烁仪等专门仪器设备；④采用放射性核素，易污染环境，需要一系列的同位素防护和处理措施。

故不能广泛开展。

目前，国外多采用“Cap-system”使RAST检测自动化，并且使检测结果更加敏感。

Cap 是内装高度亲水、具有一定弹性的载体的塑料帽状物，该载体实质上是一种纤维素的化学衍生物，具有纤维素的特性。

但Cap同普通纤维素圆盘相比，它具有三维空间的立体结构模式，增加了载体的表面积，有利于过敏原的吸附和有利于过敏原同特异性IgE快速结合。

其结合过敏原的量是相应大小的纤维素圆盘的三倍，而且也将特异性IgE同过敏原结合达到平衡所需要的时间缩短为二十分钟。

此外，利用载体的弹性，可用自动化挤压的方法把未结合的物质冲洗干净，尽量减少了测量“本底”。

目前，“Cap-system”多应用β-半乳糖苷酶( β-galsctosidase)分解底物4-甲基伞桂- β-D半乳糖苷(4-methylumbelliferryi-p-falactoside)产生荧光的原理，采用荧光酶联法(RAST FEIA)代替常用的放免法(RIA)。

这些改进使“Cap-system”能对特异性IgE进行自动化检测，而且更加敏感、特异、高效。

鉴于RAST的不足之处，我们可以看到，RAST并不能够代替病史的询问和过敏原皮试。

临床研究结果也显示皮试与临床的符合率常常比RAST结果更为接近。

世界卫生组织(WHO)在评价临床免疫学八种广泛使用的诊断方法的备忘录中指出，在以下情况下考虑作RAST的检测：①因皮肤划痕征阳性或严重皮炎不能作皮试者；②抗组胺等对症治疗药物影响皮肤反应者；③皮试可能发生危险者；④不能用于皮试的变应原，如毒素，非水溶性或高度致敏性物质；⑤食物过敏，皮试结果不可靠者；⑥皮试结果可疑者。

（二）酶联免疫吸附试验I enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）
1976年，Weltman应用单抗体法，以半乳醇苷酶标记的ELISA技术首次测定了血清中特异性的IgE抗体后，ELISA法测定血清特异性IgE的方法渐为人们所采用。

其操作方法也已经有了很大的改进。

ELISA的原理是：将过敏原吸附于聚苯乙烯小孔后，加入待测IgE，使过敏原与特异性IgE相结合，形成过敏原特异性IgE的复合物。

再加入酶标的抗人IgE抗体（常用辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶AKP标记）形成过敏原特异性IgE-酶标抗人'IgE的复合物。

最后加入酶的底物（邻苯二胺或4-硝基苯磷酸盐）酶解有色底物形成有色产物，根据颜色深浅测出特异性IgE的含量。

ELISA的一般步骤：①取洁净聚苯乙烯凹空反应板，每孔加入含过敏原的包被缓冲液，置37℃湿盒中过夜，使过敏原充分吸附于反应板；②倒去包被液，用缓冲液洗去未结合的过敏原后，每孔内加入待测血清和阴性参考血清，并设定空白对照，然后放置37℃湿盒2小时，使过敏原与特异性IgE结合；③洗去未结合的血清部分，每孔加入稀释的抗人IgE酶标抗体（如辣根过氧化物酶），再置之湿盒孵育形成三重复合物；④洗去未结合部分，每孔加入底物溶液，反应一段时间后，每孔内加入抑制剂终止酶反应；⑤酶标光度计在一定波长下测定其光密度值；⑥计算结果，以待测血清和阴性对照血清的光密度比值( P/N)来表示特异性IgE水平，以P/N≥2.1为阳性。

同RAST相比，ELISA具有简便、快速、安全的优点，而且价格便宜，可避免接触同位素；同时，酶标抗体相对稳定，可以长期保存；在准确性方面，ELISA同RAST、BPT、过敏原皮试结果有符合率高，故而目前在国内得到了广泛的应用。

在ELISA的基础上，Hawkes等人于1982年利用硝酸纤维膜能够吸附蛋白质、核酸的特性，刨建了点免疫结合试验(DOT ELISA)．使ELISA的操作更为简单，现将具体方法介绍如下：①将硝酸纤维素膜在TBS缓冲液(50mmol/L Tris-Hcl, 150mmol/LNacl，pH7,6)中浸泡10分钟后用滤纸吸干水分；②将硝酸纤维素膜切成小条，每隔一定距离(5mm)加入过敏原溶液2ul，每种过敏原做2个点，渗入后，置温箱，使其完全吸附；③TBS液冲洗数次后，将膜条置入一多槽盘中，每槽一条，各自加入稀释的血清，室温反应过夜；④洗涤后，各槽加入稀释有酶标（HRP标记）抗人IgE抗体，室温摇动一个半小时；⑤洗涤后各槽加入底物溶液（可用3mg/ml的4-氯-l-萘酚甲醇贮存液0.6ml+ 5mLTBS液+2μ130%的H2 02)，反应一段时间后用蒸馏水漂洗纤维膜，直至背景清晰；⑥判断结果，以出现蓝色斑点为阳性。

DOT ELISA检测抗原特异性IgE，其结果与ELISA基本符合，符合率达85%以上。

该方法与皮试结果的符合率也较高。

该方法与ELISA法相比，不需要特别仪器，抗原膜可以长期保存，还可同时检测多种抗原特异性IgE抗体。

三、嗜碱性粒细胞释放能力的体外检测
嗜碱性粒细胞释放能力( human basophil releasability，HBR)是指嗜碱性粒细胞在应答各种刺激时释放化学介质（脱颗粒）的能力。

众所周知，支气管哮喘的发作与否，并非直接取决于循环中IgE抗体水平，而是取决于已致敏的嗜碱性粒细胞和肥大细胞在各种特异性和非特异刺激下释放化学介质（脱颗粒）的能力。

研究表明，哮喘病人血中嗜碱性粒细胞对各种特异性的免疫刺激（过敏原）和非特异性的免疫刺激（抗IgE抗体）的反应性同哮喘发作的严重性呈平行关系。

因而嗜碱性粒细胞释放能力的检测越来越受到人们的重视，现已成为人们寻找过敏原、预示病情和判断疗效的常用方法。

它的检测方法主要有两种，嗜碱性粒细胞组胺释放试验和人嗜碱性粒细胞脱颗粒试验。

（一）嗜碱细胞组胺释放试验（histatnine release from besophil test，HRBT）HRBT是由Lichtenstein于1964年首先建立。

其原理：人血中的组胺几乎全部存在于嗜碱性粒细胞中。

哮喘病人的嗜碱性粒细胞在体外与相应过敏原孵育时，过敏原披嗜碱性粒细胞表面的IgE所识别，产生桥联反应，导致胞浆颗粒释放，从而使组胺也得到了释放，应用荧光法或同位素酶法测定组胺的水平能够反映出患者对某种过敏原是否敏
感以及机体的敏感程度。

其具体的操作方法有两种：洗涤白细胞法和全血法。

现介绍如下：
1 洗涤白细胞法
(1)制备白细胞悬液：用硅油处理的无菌注射器采集lOml静脉血，肝素化后加入3%葡萄糖3%葡聚糖溶液2ml，混匀，静置60～90分钟，直至红细胞和血浆层之闻出现明显分层。

小心吸出血浆和白细胞层，离心后弃上清。

用Tris-A缓冲液冲洗白细胞两次，最
后用含钙、镁离子的Tris-ACM缓冲液将其稀释成3×105个白细胞悬液。

(2)孵育：细胞悬液中加入待测过敏原，并在37℃条件下孵育60分钟后，离心，取上清液备测。

(3)组胺的检测：采用荧光法检测，应用正丁醇溶液提取上清中的组胺，接着用正庚烷的盐酸溶液提出组胺，然后在碱性条件下，加入苯二甲醛，产生带荧光的缩合物，用荧光分光光度计测定，并计算组胺释放率：
组胺释放率%=（过敏原管一对照管）÷（总细胞管一试剂空白管）×100%组胺释放率大于15%为阳性。

2．全血法直接将过敏原加入肝素化全血中进行组胺释放试验，可以更好地反映机体反应状态，同时还具有用血量少和操作简单的优点。

HRBT可用于评价机体的过敏反应，HRBT状态的结果与过敏性哮喘病人的临床症状、过敏原皮试及血清特异性IgE抗体水平有显著的相关性；还可以测定IgE抗体活性及检测嗜碱性粒细胞表面特异性的IgE抗体；此外也可测定特异性IgG和脱敏疗法对此抗体的影响。

HBRT的敏感度高，结果可靠，但所需仪器设备要求高，影响因素也比较多，故目前较多采用人嗜碱性粒细胞脱颗粒试验。

（二）人嗜碱细胞脱颗粒试验（human basophil degranulation test，HBDT）
HBDT利用嗜碱性粒细胞胞浆内硫酸肝素颗粒可被甲苯胺蓝和阿利新蓝等碱性染料染色的原理，在加入过敏原后，过敏原与吸附与嗜碱性粒细胞表面的特异性IgE结合，产生桥联反应，可导致嗜碱性粒细胞脱颗粒，从而使被染色的细胞减少。

因而，可以通过测定管与对照管中的被染色的嗜碱性粒细胞计数值的对比；来了解过敏原及机体过敏状况。

HBDT的一般步骤：①先制备细胞悬液，取肝素抗凝血3ml与等量pH7.6Hepes—ACM 缓冲液混合，平铺于3ml葡聚糖一泛影葡胺分离液面后，离心，用滴管轻轻吸取中间层细胞，置于含5ml同样缓冲液的试管中，充分混匀后离心，弃上清，留0.3ml悬液混匀；②孵育。

用微量加样器分别吸取不同浓度的过敏原溶液加入各试管中，再加入已制备的细胞悬液混匀；③将细胞一过敏原混合液置37℃水浴，然后用阿利新蓝( Alcianblue)染色后，滴入计数板，数两个九大格嗜碱性粒细胞数，取均值计算脱颗粒指数(Degranulation index, DI):DI=（对照管嗜碱性粒细胞数一测定管嗜碱性粒细胞数）÷对照管嗜碱性粒细胞数×100%DI> 30%为阳性。

HBDT可用于过敏原的检测和哮喘发病机制的研究。

同HBRT相比，具有设备简单、价格低廉、操作简单、易于在基层医院开展的优点。

但本法不适用于少数外周血嗜碱性粒细胞数少于20个/μl的病人。

第二节非特异性免疫学检测试验
一、血清中总IgE的检测
本试验主要检测血清中的总IgE水平。

IgE是支气管哮喘发病有关的重要的免疫球蛋白。

支气管哮喘病人血清中的总IgE常有升高，血清中的总IgE水平的升高也预示了受试者患有支气管哮喘等特应性疾病。

目前，检测血清IgE的常用方法包括纸片放射免疫吸附试验、酶联免疫法、反向被动血凝试验、放免吸附技术、放射单扩散技术等。

(一）纸片免疫吸附试验( paper radioimmunosorbent test，PRIST)
国外多采用此法检测血清中的总IgE。

1．原理及步骤
(1)将抗IgE抗体偶联于经溴化氢活化的滤纸片上；
(2)加入待测标本或IgG标准品，形成抗IgE - IgE的复合物；
(3)加入125I标记的抗IgE抗体，形成抗IgE-lgE-125I_抗IgE复合物；
(4)测定复合物的放射性活度，根据标准曲线确定代测血清中总IgE的水平。

2评价PRIST具有灵敏度高、重复性好的优点，但需要γ-计数器或液体闪烁仪等检测设备，费用高，并需要一定的同位数防护和处理措施，因此在国内临床应用受到很大的限制。

（二）酶联免疫吸附测定（enzyme linded immunosorbent assay．ELISA）
ELISA测血清总IgE在国内应用较为广泛。

目前经常采用双抗体法。

1．原理及步骤
(1)将抗人IgE包被于聚苯乙烯微量测定凹空板中；
(2)加入待测血清样品或标准品与之相结合，形成抗人IgE -IgE复合物；
(3)加入辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗人IgE抗体，形成抗人IgE - lgE-酶标抗人IgE复合物；
(4)洗去菲结合部分后，加入酶的底物邻苯二胺或4-硝基苯磷酸盐；
(5)根据酶解底物呈现的颜色反应，应用微量分光光度计测定光密度值，从标准曲线
上查出待测血清总lgE的量。

2．评价ELISA法具有特异、敏感、迅速、简单、易于开展的优点。

但仍需要一定的检测仪器、费用也较高。

（三）反向被动血凝试验(rerersed passive hemmmogglutination test，RPHAT]
是一种半定量的血清总IgE测定方法。

1．原理及步骤应用戊二醛或甲醛固定绵羊红细胞；将抗人IgE结合于绵羊红细胞使之成为“致敏红细胞”；对待测血清进行二倍法稀释，然后分别在各管中加入“致敏红细胞”；观察不同血清浓度试管中红细胞的凝集情况，从而了解总IgE的水平。

2.评价RPHAT法不需要特别仪器、操作简单、快速、经济的优点，能够在我国广大基层医院开展应用。

但其敏感性较ELISA法和PRIST法稍低。

（四）放射单扩散法（radioactive single radical diffusdion technique，RSRD）和放射免疫吸附技术( radio immunosorbent technique．RIST)
前者操作复杂、敏感性低，而后者国内缺少必要的试剂，因两者在国内很少应用故不再赘述。

二、嗜酸性粒细胞及其介质的检测
嗜酸性粒细胞是支气管哮喘发病过程中的重要细胞，它在哮喘的迟发性的反应中起着关键的作用。

早已明确，支气管哮喘患者支气管肺泡灌洗液和痰液中，嗜酸性粒细胞明显升高，而对于具有双相哮喘反应者同时还伴有血嗜酸性粒细胞的升高。

故而，嗜酸性粒细胞的检测成为支气管哮喘免疫学诊断的一个重要方面。

（一）血液嗜酸性粒细胞计数
利用嗜酸性粒细胞中的颗粒的染色反应进行计数细胞，常用的染色液有伊红甲醛稀释液、伊红甘油稀释液及伊红一丙酮稀释液三种。

其一般步骤为：①吸取稀释液0. 38ml 加入试管内；②用毛细取血管吸取末梢血液20μL加入该试管内，轻轻混匀，静置五分钟；
③用滴管吸取少量样品滴入Fuchs-Rlsenthal血球计数池内，用低倍镜观察10个大方格内的嗜酸性粒细胞数（嗜酸性粒细胞被染成桔红色）；④计算，嗜酸性粒细胞数/L= 10个大方格内嗜酸性粒细胞数×20×106，正常值为(0.05～0.3)×l09/L。

（二）痰液的嗜酸性粒细胞计数
痰液是来源于气道表面的粘液，因而对痰液嗜酸性粒细胞的检测能够反映气道的嗜酸性粒细胞的炎症情况。

其方法及步骤如下：①用棉签蘸取或用小的金属钩和剪刀切取痰块的一小部分，涂f载玻片上；②滴加等体积的leishman染液（含伊红和亚甲蓝）并用细棒轻轻搅匀，轻轻压上盖玻片，十分钟至数小时内观察结果，轻微加热玻片可加快染色过。