实验三血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳

实验三⾎清蛋⽩醋酸纤维素薄膜电泳
实验三⾎清蛋⽩醋酸纤维素薄膜电泳
醋酸纤维素薄膜电泳分析技术是⽬前临床常规测定中应⽤最⼴的⽅法，具有微量、快速、简便、吸附作⽤和电渗作⽤⼩、分离区带清晰、灵敏度及分辨率⾼等特点。

醋酸纤维素薄膜还可进⾏透明化处理，便于照相和扫描计算结果。

⼴泛应⽤于⾎清蛋⽩、⾎红蛋⽩、糖蛋⽩、脂蛋⽩、结合球蛋⽩、同⼯酶的分离和测定。

【⽬的】
1.掌握电泳法分离蛋⽩质的原理、操作⽅法。

2.了解电泳法分离蛋⽩质的临床意义。

【原理】
带电粒⼦在电场中向与其电性相反的电极泳动的现象称为电泳。

⾎清中各种蛋⽩质的等电点⼤多在pH4.0～7.3之间，在pH8.6的缓冲液中均带负电荷，在电场中都向正极移动。

由于⾎清中各种蛋⽩质的等电点不同，因此在同⼀pH环境中所带负电荷多少不同，⼜由于其分⼦⼤⼩不同，所以在电场中泳动速度也不同。

分⼦⼩⽽带电荷多者，泳动速度较快；反之，则泳动速度较慢。

因此通过电泳可将⾎清蛋⽩质分为5条区带，从正极端依次分为清蛋⽩、α1球蛋⽩、α2球蛋⽩、β-球蛋⽩和γ球蛋⽩等，经染⾊可计算出各蛋⽩质含量的百分数。

【器材】
醋酸纤维素薄膜（2cm×8cm）、培养⽫、滤纸、⽆齿镊、剪⼦、加样器（可⽤盖玻⽚或或微量加样器）、直尺、铅笔、玻璃板（8cm×12cm）、试管、试管架、吸管、电泳仪、电泳槽、分光光度计或吸光度扫描计。

【试剂】
1. 巴⽐妥缓冲液(pH8.6，0.07mol/L，离⼦强度0.06)
称取巴⽐妥钠12.76g、巴⽐妥1.66g，加500毫升蒸馏⽔，加热溶解。

待冷⾄室温后，再加蒸馏⽔⾄1000毫升。

2. 氨基⿊10B染⾊液
称取氨基⿊10B 0.5g加⼊冰醋酸10ml、甲醇50ml,混匀，加蒸馏⽔⾄100ml。

3. 漂洗液
甲醇45ml、冰醋酸5ml，混匀后加蒸馏⽔⾄100ml。

4. 洗脱液 0.4mol／LNaOH溶液。

5. 透明液
称取柠檬酸21g，N-甲基-2-吡咯烷酮150g，以蒸馏⽔溶解并稀释⾄500ml。

【操作】
1. 准备
将缓冲液加⼊电泳槽的两槽内，并使两侧的液⾯等⾼。

裁剪尺⼨合适的滤纸条，叠成四层贴在电泳槽的两侧⽀架上，⼀端与⽀架前沿对齐，另⼀端侵⼊电泳槽的缓冲液内，使滤纸全部湿润，此即“滤纸桥”（图3-1）。

将醋酸纤维素薄膜切成2cm×8cm⼤⼩，在⽆光泽⾯的⼀端约1.5cm处，⽤铅笔轻划⼀直线，作为点样位置。

然后将⽆光泽⾯向下，置于盛有巴⽐妥缓冲液的培养⽫中浸泡，待充分浸透（约20分钟）即⽆⽩⾊斑点后取出，⽤洁净滤纸轻轻吸去表⾯的多余缓冲液。

2. 点样
取少量⾎清于玻璃板上，⽤加样器取少量⾎清(约2～3µl)，加在点样线上，待⾎清渗⼊膜内，移开加样器。

点样时应注意⾎清要适量，应形成均匀的直线，并避免弄破薄膜（图3-2）。

图3-2 电泳点样位置⽰意图
3. 平衡与电泳
将点样后的薄膜有光⾯朝上，点样的⼀端靠近负极，平直地贴于电泳槽⽀架的滤纸上，平衡约5分钟。

盖上电泳槽盖，通电进⾏电泳。

调节电压为100～160伏，电流0.4～0.6mA ／cm宽，夏季通电45分钟，冬季通电60分钟，待电泳区带展开2.5～
3.5cm时断电。

4. 染⾊
⽤⽆齿镊⼩⼼取出薄膜，浸于染⾊液中1～3分钟（以清蛋⽩带染透为⽌）。

染⾊过程中应轻轻晃动染⾊⽫，使薄膜与染⾊液充分接触，薄膜量较多时，应避免彼此紧贴⽽影响染⾊效果。

5. 漂洗
准备3个培养⽫，装⼊漂洗液。

从染⾊液中取出薄膜，依次在漂洗液中连续浸洗数次，直⾄背景⽆⾊为⽌。

将漂净的薄膜⽤滤纸吸⼲，从正极端起依次为清蛋⽩（A）、α1、α2、β及γ-球蛋⽩（图3-3）。

6.定量
(1)洗脱法：取6⽀试管，编号，分别为A、α1、α2、β、γ和空⽩管。

于清蛋⽩管加⼊0.4mol/LNaOH溶液4ml,其余5管加2ml。

剪下各条蛋⽩区带，另于空⽩部分剪⼀条与各蛋⽩区带宽度近似的薄膜作为空⽩，分别浸⼊各管中，振摇数次，置37℃⽔浴20分钟，使⾊泽完全浸出。

⽤620nm波长以空⽩管调零⽐⾊，读取各管吸光度，按下式计算：T = A×2 + α1 + α 2 + β + γ
清蛋⽩% ＝清蛋⽩管吸光度×2/T×100
α1-球蛋⽩% ＝α1-球蛋⽩管吸光度/T×100
α2-球蛋⽩% ＝α2-球蛋⽩管吸光度/T×100
β-球蛋⽩% ＝β-球蛋⽩管吸光度/T×100
γ-球蛋⽩% ＝γ-清蛋⽩管吸光度/T×100
(2)扫描法：待染⾊的醋酸纤维素薄膜完全⼲燥，置透明液中约3分钟，取出贴于玻⽚上，薄膜完全透明。

将已透明的薄膜放⼊全⾃动光密度计中，对蛋⽩区带进⾏扫描，⾃动绘出电泳图，并直接打印出各区带的百分含量。

【注意事项】
1. 标本不能溶⾎，否则，β球蛋⽩浓度偏⾼。

2．每次电泳时应交换电极，以使两侧电泳槽内缓冲液的正负离⼦相互交换，使缓冲
液的pH维持在⼀定⽔平。

3．电泳槽缓冲液的液⾯要保持⼀定⾼度，过低可能出现了球蛋⽩的电渗现象(向阴极移动)。

同时，电泳槽两侧的液⾯应保持在同⼀⽔平⾯，否则，通过薄膜时有虹吸现象，将会影响蛋⽩质分⼦的泳动速度。

4．电泳时电泳槽要密闭，以保持湿度，否则，薄膜⽔分蒸发⼲燥，使电流下降，分离不佳。

5．电泳失败或图谱不理想的常见原因。

(1)电泳图谱不整齐：①点样不均匀；②薄膜未完全浸透或温度过⾼致使膜⾯局部⼲燥或⽔分补给不⾜；③缓冲液变质；④电泳时薄膜放置不正，与电流⽅向不平⾏。

(2)各蛋⽩区带分离不清晰：①点样过多；②电流过低，多由薄膜过于致密、吸⽔性差、导电能⼒差引起；③膜⾯⼲燥；④薄膜过薄。

(3)清蛋⽩中间着⾊浅：①染⾊时间不够或染⾊液陈旧；②清蛋⽩含量过⾼，可减少⾎清⽤量或延长染⾊时间。

(4)电泳速度慢：①电流过低；②供给薄膜的缓冲液不⾜，连接薄膜与缓冲液的滤纸或纱布过薄(⼀般需4层)；③温度过低，冬季电泳速度较夏季慢；④薄膜结构过于致密，导电性差；⑤缓冲液中⽔分蒸发，致使离⼦强度增⼤。

6．样品要求点在粗糙⾯(⽆光泽⾯)，否则，样品很难吸⼈膜内。

电泳时最好将点有样品的⼀⾯朝下，以防电泳过程中⽔分蒸
发，影响电泳结果。

7．染⾊时间以2分钟为佳(室温低时，时间可稍长)，若时间过长，可使α1球蛋⽩与染料结合率增加，导致α1球蛋⽩百分⽐上升。

【正常参考值】
清蛋⽩： 57.45～71.73%
α1-球蛋⽩： 1.76～4.48%
α2-球蛋⽩： 4.04～8.28%
β-球蛋⽩： 6.79～11.39%
γ-球蛋⽩： 11.85～22.97%
A/G 1.24～2.36
【临床意义】
急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭时，清蛋⽩降低，α1、α2和β-球蛋⽩升⾼；慢性活动性肝炎、肝硬化时，清蛋⽩降低，β、γ-球蛋⽩升⾼；急性炎症时，α1、α2-球蛋⽩升⾼；慢性炎症时，清蛋⽩降低，α2、γ-球蛋⽩升⾼；红斑狼疮、类风湿关节炎时，清蛋⽩降低，γ-球蛋⽩显著升⾼；多发性⾻髓瘤时，清蛋⽩降低，γ-球蛋⽩升⾼，
于β和γ-球蛋⽩区带之间出现“M”带。

【结果及分析】
【思考题】
1.⾎清蛋⽩质电泳时为什么要将点样的⼀端靠近负极端？
2.醋酸纤维素薄膜电泳可将⾎清蛋⽩依次分为哪⼏条区带，有哪些临床意义？。