毕业论文【设计】基于流式细胞仪的水中细菌总数和藻类的快速测定与研究

目录
摘要 (I)
Abstract (II)
第1章绪论 (1)
第2章流式细胞仪的原理及应用现状 (1)
2.1 流式细胞仪工作原理 (1)
2.1.1 液流系统 (2)
2.1.2 光路系统 (2)
2.1.3 检测分析系统 (3)
2.2 流式细胞仪操作步骤 (3)
2.3流式细胞术在国内外应用的现状 (4)
第3章细菌的计数 (5)
3.1 平板菌落计数法 (5)
3.1.1 实验仪器和材料 (5)
3.1.2实验步骤 (5)
3.2流式细胞仪计数法 (6)
3.3细菌测定结果 (6)
第4章藻细胞的计数 (8)
4.1 显微镜计数法 (8)
4.1.1实验基本原理 (8)
4.1.2实验器材 (8)
4.1.3 操作步骤 (8)
4.2流式计数法 (9)
4.3 结果与讨论 (9)
4.4 藻细胞的梯度测试 (12)
4.5 实时监测藻类和水中细菌的数目变化 (14)
第5章藻的死活状态分析 (16)
5.1 藻细胞死活状态检测 (16)
5.2 实验结果与分析 (16)
第6章藻的毒性测试材料与方法 (19)
6.1 材料 (19)
6.1.1 实验材料 (19)
6.1.2 实验仪器与设备 (19)
6.1.3 实验试剂 (19)
6.2 实验方法 (22)
6.3 羊角月牙藻的毒性测试 (22)
6.3.1 实验条件 (22)
6.3.2 藻类培养基的配制 (22)
6.3.3 羊角月牙藻的培养 (23)
6.4 藻的死活状态、凋亡状态分析以及DNA含量测定 (25)
6.4.1 藻的死活状态分及凋亡状态分析 (25)
6.4.2 DNA周期分析 (26)
第7章藻的毒性机理研究 (28)
7.1四溴的毒性效应 (28)
7.2 4溴的毒性效应 (30)
7.3 十溴的毒性效应 (31)
7.4 PFOS的毒性效应 (32)
7.5 Fe(NO3)3的毒性效应 (33)
7.6 Pb(NO3)2的毒性效应 (34)
7.7 Cd(NO3)3的毒性效应 (35)
第8章结论与展望 (36)
8.1 结论 (36)
8.2 展望 (37)
致谢 (38)
参考文献 (39)
附录 (41)
基于流式细胞仪的水中细菌总数和藻类的快速测定与研究
摘要:本文的研究对象是水中细菌和藻类,使用的仪器主要是流式细胞仪,运用流式细胞仪对细菌总数和藻类进行测定,并尝试着尽可能多的利用流式细胞仪对研究对象进行深入的多方面的探讨.本文主要研究内容有以下几个方面:
(1)分别采用平板计数法和流式计数法对水中细菌进行计数,观察比较得出结论:流式细胞仪计数和传统的平板计数法之间存在着较好的线性关系,（R2>0.900）,因此,可以直接用流式细胞仪对细菌进行测定.
(2)分别对藻类（本实验使用的藻类全部为羊角月牙藻）采用显微镜直接观察计数和流式细胞仪计数,将结果进行分析观察比较,可得出结论:藻的流式细胞仪计数及显微计数之间存在着很好的线性关系（R2>0.950）,可以直接用流式细胞仪对藻类进行测定,且对藻类的计数比细菌的更加精确.
(3)除了直接计数之外,本研究还对藻细胞的死活状态进行鉴定,采用的是 SYBR Green Ⅰ和碘化丙啶双染色的方法,通过将藻细胞煮沸杀死,按照死亡比例分别为0%、25%、50%、75%、100%进行检测,观察相应的密度图可以明显的区分出死活细胞的大致分布和既定的比例之间有非常好的关系.
(4)探究重金属及有机污染物对藻类的毒性机制,分析致毒过程是否和细胞膜的损伤、细胞凋亡以及细胞周期有所关联,实验表明:毒性越强,藻的细胞膜损伤越严重,细胞死活
之比越高；细胞的凋亡状态与毒性物质的关系不太明显；细胞周期中G1期的变化波动性较大,但是总体呈现一个下降的趋势,S期的变化大致是先增加后趋于平缓,G2期走势也是不断降低的.
关键词:流式细胞术细菌藻类快速检测死活鉴定细胞周期
Rapid Detection and Research of Bacteria and Algae in Water by
Flow Cytometry Assay
Abstract:At present, the determination of the total number of bacteria in water is usually flat plate counting method, but the method is complex, heavy workload, and can only measure less than 1% of the number of live bacteria in the water, and it takes at least 24 hours. So it is very necessary to establish a more comprehensive, faster detection method, that is, flow cytometry. This technology uses the flow cytometer, it is a new high-tech equipment which begins in the late 1960s, it combines the application of fluid, optics, electronics, biology, immunology and other disciplines and technology in one. The core of its technology is the flow cytometry, using the flow cytometry so that individual cells or other tiny biological particles are in a state of rapid linear flow, one by one goes through the beam, can analysis or sort a single cell or particles for multi-parameters (such as the number of cells, particle size, DNA content, etc.), with the advantages of high speed, high accuracy , simple operation and so on.
The main contents of this paper are as follows:
(1)Using the plate counting methodand flow cytometry to count the bacteria respectively. The results showed that there was a good linear relationship between flow cytometry and traditional plate counting method (R2> 0.900). So we can conclude that bacteria can be directly measured by flow cytometry.
(2)Using the microscope and flow cytometry to count the algae respectively (algae used in this experiment are all clawgrass algae).There is a good linear relationship between the both ways (R2> 0.950). The algae can also be measured directly by flow cytometry, and the count of algae is more accurate than that of bacteria.The results were analyzed and compared, it can be concluded that flow cytometry is significant for algae.
(3)Besides direct counting, this study also identified the life and death status of algal cells, using SYBR GreenⅠ(SYBR) and propidium iodide (PI) double staining method, to hit the algal cells by boiling to death, then let the death rate are 0%, 25%, 50%, 75%, 100%, observe the corresponding density map we can clearly distinguish between the distribution of dead cells and find that the established ratio is similar to the death rate.
(4)In order to study whether the results caused by the toxicity of the heavy metal was related to the cell membrane damage, cell apoptosis and cell cycle,this paper also explores the toxicity mechanism of heavy metals and emerging organic pollutants to algae. The results showed that the stronger the toxicity was, the more serious the cell membrane were damaged ,the higher celldeath rate was;but the change of cell apoptosis status was not too obvious; the cell cycle at all stages of the DNA distribution of S phase DNA content decreased generally. the cell cycle in G1 phase did not change steadily, but overall showed a downward trend, the change of S is roughly increased and then leveled off, G2 is constantly decreasing .
Keywords: flow cytometry (FCM); bacteria,algea; rapid detection;detection of life and death identification;cell cycle
第1章绪论
在传统的方法中,水源性细菌的常用统计方法为平板计数法,但是这种方法有几个难以克服的缺陷[1],因为它不仅耗费时间,至少需要24h的培养时间,而且步骤复杂,工作量大,且能检测到的细菌种类还达不到水中细菌总数的1%,并且
平板法只可对活菌进行计数,因此,很有必要建立一个更加全面、速度更快的检测方法.这时流式细胞术（Flow cytometry,FCM）却可以同时克服耗时长和误差大的缺点,它不仅能够快速测出细菌总数,还可区分活菌和死菌,得到活菌百分比或者死菌百分比[2].通过采用碘化丙啶(PI)作为荧光染料,然后用流式细胞仪就可
检测并计数死菌数目,这种方法不仅具有检测快速、操作步骤简单,而且计量的结果也十分精确.此种方法对于藻类的检测也同样适用,本实验采用的藻类是羊角月牙藻,羊角月牙藻是一种十分常用的模式生物.
流式细胞技术从20世纪60年代后期创建以来,得到了很快的发展[3],最初是应用于科学研究和临床检验中,但是在微生物学方面的应用却较少,原因是微生物的细胞颗粒较小,所以发出的光信号相对弱一些,不便于机器接收,因此检测起来不太方便[4].而在国外,流式细胞术已经能够广泛的应用于细菌的常规工作中,在国内却尚未得到充分的发展,所以流式细胞术在国内还有十分大的发展空间和开阔的应用前景[5].
在这个工业化迅猛发展的时代,环境污染特别是水体污染变得一天比一天严重,人们不合理的利用水资源造成了水资源危机,以及水质的恶化,这已经日渐影响到人们的正常生活,因此水质的快速、准确检测对人类的健康和环境保护具有非常重大的意义,因此很有必要用流式细胞技术对水中细菌和藻类进行研究[6].
第2章流式细胞仪的原理及应用现状
2.1 流式细胞仪工作原理
流式细胞仪的工作原理[7],简单地说就是一定波长的激光束直接照射到高压驱动的液流内的细胞,产生的光信号被多个接收器接收,其中一个是在激光束直线方向上接收到的前向角散射光信号,其他的是在垂直方向上接收到的光信号,包括侧向角散射光信号和荧光信号[8].液流中悬浮的细胞能够使激光束发生散射,而细胞上结合的荧光素被激光激发后能够发射波长高于激发光的荧光,散射光信
号和荧光信号被相应的接收器接收后,根据接收到信号的强弱即可反映每个细胞的物理和化学特征[9].
流式细胞仪有很多类型,各种类型仪器之间虽然差别较大,但是却有着相同的基本结构.一般分为几个系统:液流系统、光路系统、检测分析系统以及分选系统[10].流式细胞仪分为两大类:一类是是分析性流式细胞仪,另一类是分选型流式细胞仪.前者由前三个系统构成,而后者比前者多了一个分选系统装置.本实验用的是分析型流式细胞仪,下面简介一下前三个系统的工作原理.
2.1.1 液流系统
流式细胞仪的液流系统由两套紧密联系而又相互独立的液流组成,即鞘液流和样品流.
鞘液流从鞘液桶开始,流经专门的管道进入喷嘴,经喷嘴的小孔形成稳定的可见的液流[2].液流系统的作用是依次将待测样本中的细胞传送至激光照射区,把细胞传送至激光束的中心是理想的状态[11].液流系统一般最常用的控制方法是正压法,即利用正压使鞘液进入流动室,同时加压到样本管中,让鞘液和样本流于流动室中混合均匀,然后经过激光照射产生相应的信号.增加样本压力即加宽液柱从而增加样本流动速度[12].
本实验用的流式细胞仪有三种流速:低速、中速和高速.选用的流速是低速,因为选择高流速时,处于样本流不同位置的细胞可能受激光照射的能量不一样,会出现测量误差,因此,为了进行更精确细致的分析细胞,比如DNA的分析就应该选择低速[13].
2.1.2 光路系统
光信号分为两种:一种是散射光信号,另一种是荧光信号,这是流式细胞仪的精髓,之所以这么说是因为流式细胞仪是以激光照射细胞接收到光信号为基础,再对细胞进行分析.
光路系统开始于激光器,在流式细胞仪中,它是必要的组成原件之一.激光器的一般根据其发射的激光的波长来分,我们实验室有488nm的激光器和640nm的激光器.
激光照射到样本流中的的细胞后,就会产生散射光.流式细胞仪采集的光信号包括两种:散射光信号和荧光信号.散射光信号也包括两种:一种是正对激光方
向接收的前向角散射光（forward scatter,FSC）,另一种是与激光方向在一个水平面上且与激光成90度角的侧向散射光（side scatter,SSC）.FSC,即前向角散射,它的值代表细胞的大小.也就是说,细胞体积越大,它的值也就越大.因此通过观察细胞的FSC值就可初步比较细胞大小,对细胞进行分类或者分群.
SSC,即侧向角散射,它的值象征着细胞的颗粒度.如果细胞越不规则,细胞表面的突起越多的话,那么细胞内能引起激光散射的细胞器或颗粒物质越多,其值就会越大.于是也可利用SSC值对细胞的颗粒度进行比较,从而对细胞分门别类.
2.1.3 检测分析系统
流式细胞仪的检测分析是把通道作为单位,然后将细胞的各个通道的光信号汇总分析,最后得到样品中细胞的物理化学特征.流式细胞仪划分通道的依据是光信号的差异,将其分为散射光通道和荧光通道.散射光通道的用途是用来接收散射光,即上面说的前向角散射光通道和侧向角散射光通道.荧光通道的作用就是来接收细胞上结合的各荧光素发射出来的荧光信号.
我们实验室用的流式细胞仪有2个散射光通道和6个荧光通道.6个荧光通道分别是:488nm的蓝色激光检测6色荧光,640nm红色激光器检测2色荧光. 2.2 流式细胞仪操作步骤
（1）开机准备
在正式的实验开始之前,要先开启流式细胞仪,仪器会自动清洗管路,防止上次的试验样品对新的试验样品造成影响,提高准确率.
（2）制备单细胞悬液
因为流式细胞仪的工作原理就是逐个的检测细胞,所以为保证细胞能够正常受到检测,一定要制成单细胞悬液[14].有的细胞可以直接使用,比如悬浮培养的样品、各种腹水细胞等.对于成团成块的细胞,要用一些方法将其分散开来:比如酶法、化学法和机械法等方法.流式细胞术不能直接检测分子,但是用人工合成的颗粒代替细胞,然后将其与人工颗粒混合均匀,就可以间接的对分子进行检测.
（3）细胞的荧光染色
其实,如果对单细胞悬液样品不做任何染色处理,也可以直接上机检测,原因是细胞本身的额一些特征就会被流式细胞仪检测出来,比如FSC-SSC的密度图中,可以分辨出细胞的大小和颗粒复杂程度,凭借着这些特征,能够将样品进行初步
的大致的分类.但是,要想更加精确,更加清晰的分辨出细胞的种类,这是就需要对样品细胞进行相应的荧光染色[15].染色剂的种类很多,功能也各不相同.比如用碘化丙啶（PI）可以检测出膜的完整性,羧基荧光素二醋酸（CFDA）可以检测细胞的酶酯活性,5-氰基-2,3二甲苯基氯化亚唑（CTC）能够检测细胞的呼吸活性等等.选用荧光试剂的时候不仅要看荧光染料的功能,也要看使用的流式细胞仪是否有它需要的荧光通道,因为不同的荧光试剂有不同的激发波长和发射波长,然后按照对应的方法进行染色处理,上机检测结果[16].
（4）观察分析结果
检测完毕后,要对样品的结果进行分析处理.流式细胞仪有好几个图形:散点图、密度图、柱形图、等高图、细胞周期图,但是最常用的还是散点图和密度图,相比之下,密度图比散点图更便于观察分析,所以本实验分析数据时采用的是密度图.一般在分析过程中,先用FSC-SSC密度图对细胞进行分类,分类的依据是细胞的大小与颗粒度.然后根据目标细胞处于的群体位置,再将该群体细胞圈门,进一步对目标细胞进行深入分析[17].
2.3流式细胞术在国内外应用的现状
（1）首先用一张图来简要说明一下流式细胞仪的用途,如下图所示:
图2.1 流式细胞仪的检测范围
（2）流式细胞仪的应用现状
流式细胞仪是20世纪70年代初发展起来的,其最初应用于医学领域的研究,其检测技术准确高效,让许多其他的传统检测手段难以与之较量[18].现如今,流式细胞仪已经慢慢的发展起来,其应用领域也从细胞生物学基础扩大到肿瘤学、血液学、免疫学、药物学、临床检验等各个方面[17].流式细胞术是一个应用非常广泛的技术,它的出现与发展涉及多种学科与技术,包括细胞与分子生物学、流体力学、电磁理论、生物技术、激光技术与荧光技术、光电子技术、单克隆抗体技术、
计算机技术与纳米技术等等[19].历经了将近半个世界的发展,流式细胞术越发成熟,在医学领域可谓是炉火纯青,已经成为了医学领域必不可少的技术[19].除此之外,流式细胞仪还成功的应用于水处理中[19, 20]水中细菌、病毒、特殊病原菌、藻细胞的快速测定等；生物学中[21]对细胞凋亡、细胞周期的研究等；植物学中[22]对细胞核分析、染色体分析、植物细胞和染色体分选、染色体文库构建、逆境生物学和育种学等；水生动物学中[23]细胞的分类和分选、细胞免疫功能研究、细胞核的DNA研究与精子质量评价；食品微生物学[24]中判断细菌的活性与检测食源性病菌、环境监测、卫生防疫等各个方面,并且还正在不断的向各个领域深入发展.
流式细胞术的应用极广,简而言之,只要是能被荧光分子标记的细胞或微粒都可以被流式细胞仪检测,特别的，对于形体极其微小的粒子来说,其逐个检测、便捷、灵敏、多角度分析等长处更为突出[25].流式细胞仪没有全面的普及应用的原因之一就是它的成本较高，但是，随着时代的发展，科技的不断创新进步，流式的发展会越来越好，前景也会越来越广阔。

第3章细菌的计数
3.1 平板菌落计数法
细菌[26]菌落总数指的是1ml水样在营养琼脂培养基中,在37℃的恒温培养箱中培养24h后所生长的腐生性细菌菌落总数[27].
3.1.1 实验仪器和材料
（1）实验仪器
高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、酒精灯、培养皿、试管、刻度移液管、锥形瓶、烧杯、量筒、药物天平、玻璃棒、石棉网、药匙、铁架、表面皿、pH试纸.
（2）实验材料
牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、氢氧化钠、自来水、蒸馏水、红河水、明德湖水、至善湖水.
3.1.2实验步骤
（1）取水样
用干净的空矿泉水瓶子去分别去红河、明德胡、至善湖取水样,每个采样点各取一瓶,拿回实验室,贴上标签,写上采样时间地点,做好标记.
（2）配置培养基
牛肉膏蛋白胨培养基的配方:牛肉膏0.5g,蛋白胨1g,氯化钠0.5g,琼脂2.0g,水100ml,pH7.2-7.4.
a.配置溶液:取一定容量的烧杯盛入定量的蒸馏水（也可用自来水替代）按培养基配方依次称取各种成分,依次加到水中溶解.因为牛肉膏、蛋白胨不好溶解,所以可以加热搅拌促进其溶解.
b.调节pH:因为配好的培养基往往都是偏酸性的,所以要用质量浓度为
100g/L的氢氧化钠来调节pH,应该缓慢加入氢氧化钠,边加边搅拌,并不时用pH 试纸测量pH直至达到规定的值.
c.高压灭菌:用高压蒸汽灭菌锅中,121℃条件下灭菌15-20min.
(3)制作平板
a.将培养皿编号:每个样品各准备三个培养皿作为平行实验.
b.将采样的水样适当稀释后,加入培养基:取1支1ml无菌移液管,从低浓度开始,各加1ml菌液于相应编号的培养皿中.
c.倒平板:将高压灭菌并冷却至50℃左右的培养基倒入培养皿中,右手拿
有培养皿的锥形瓶,左手拿培养皿,倒入培养基后再把培养皿平放在桌子上,将培
养皿顺时针和逆时针来回转动,充分混合培养基和菌液.等到培养皿冷凝形成平板.然后将其倒置放在37℃的恒温培养箱中培养24-48h.
d.观察结果计数:到了时间后,将培养皿拿出,观察、分析实验结果.
3.2流式细胞仪计数法
每个样品充分震荡混合均匀后,用单吸道移液管各吸取50微升,放到流式细胞仪专用的样品管中,直接上机检测.为了提高测量的准确度,尽可能的减小实验误差,所以每个样品各进行三组平行实验,最后取三者的平均值作为最终结果. 3.3细菌测定结果
表3.1 流式细胞仪法和平板计数法检测的实际水样中的细菌浓度
流式计数法（*106/ml）平板计数法（CFU/ml）
蒸馏水16 2
自来水56 31
红河水1 774 500
明德湖1 240 123
至善湖1 406 297
红河水2 362 260
明德湖2 120 46 至善湖2
198
95
图3.1 平板计数法与平板计数法柱形图的比较
图3.2 平板计数法与平板计数法散点图的比较
由图3.2分析得，相关拟合数据为：
9989.304208.1+=x y
633.2,85.301,3495.0,9773.0,82
->====E P F RMSE R n adj
流式计数法
平板计数法
通过origin进行线性拟合,可得出两者的关系式,y代表流式细胞仪计数结果,x 代表平板菌落计数法,线性关系拟合好.上述结果是本实验中线性拟合最好的结果,当然实验过程中并不是所有的结果都拟合的非常好,其余不太好的结果此处就不再一一列举。

另外,在实验过程中我发现了一个问题,流式细胞仪对水中细菌的检测在一定范围内是精确的,但是超过了这个范围,计量结果就不是太准确了.我用的水样分别是红河水、明德湖水、至善湖水、自来水、蒸馏水,想做几个梯度看看流式细胞仪测量结果是否也呈现相应的梯度变化,具体方法就是,将红河水进行稀释,分别用蒸馏水将其稀释到10、100、1000、10000、100000倍进行测定,发现稀释1000倍和10000倍的结果接近,且结果接近蒸馏水测定的结果.这说明,就红河水样来说,最大检测范围就是稀释1000倍了,如果再进行稀释,测量结果就不能作为参考了,但是在这个范围之内的结果还是可以使用的.
第4章藻细胞的计数
4.1 显微镜计数法
4.1.1实验基本原理
通过血球计数板在光学显微镜视野下进行计数,是常用的微生物计数方法..将经过适当稀释的样品放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中,在显微镜下进行计数.因为计数室的容积是一定的(0.1mm2),所以可以利用显微镜下观察到的微生物数目来进行总的换算.但是这种方法计得的是死活菌体的总和,所以这也叫作总菌计数法.
4.1.2实验器材
藻液,血球计数板,显微镜,盖玻片,载玻片,移液管.
4.1.3操作步骤
(1)稀释
如果所测菌液的浓度较高,那么就需要进行适当的稀释处理；如果浓度不高,便不作稀释处理,可以直接使用.
(2)镜检计数室
在放置样品之前,必须先对计数板的计数室镜检观察.看里面是否有杂质没有方可使用；若有杂质,就要进行清洗.
(3)加样品
将镜检后合格的血球计数板盖上盖玻片,再用移液管将藻液吸取100微升,慢慢地让藻液沿缝隙进入计数室,注意不能有气泡产生,以免影响观察计数.
(4)显微镜计数
将血球计数板放到显微镜载物台上,先用低倍镜找到计数室大致位置,再换成高倍镜进行细致观察计数.在计数前如果发现菌液浓度不合适,就需要重新调节稀释倍数.一般每小格内约有5-10个菌体才算合适.每个计数室选5个中格中的菌体进行计数.位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的.在计数的过程中,一定要集中精力,做到不重不漏.
(5)清洗血球计数板
使用完毕后,要把血球计数板进行清洗,先用自来水冲三遍,再用蒸馏水冲洗三遍,洗完后用擦镜纸擦干或者让它自行晾干.镜检,观察每小格内是否有污物或者残留的藻液,若有,就要重复洗涤至干净为止.
4.2流式计数法
每个样品充分震荡混合均匀后,用单吸道移液管各吸取50微升,放到流式细胞仪专用的样品管中,直接上机检测（用流式细胞仪检测的具体步骤详见附录）.为了提高测量的准确度,尽可能的减小实验误差,所以每个样品各进行三组平行实验,最后取三者的平均值作为最终结果[28].
4.3 结果与讨论
表4.1 藻的显微计数与流式计数的比较
序号藻的显微计数/(个) 流式细胞计数/(*106)
1 11
2 1035
28 327
70 748
53 466
89 720
90 882
93 819
31 383
11 214 2 63 425 100 805 87 751 53 499 31 261 25 218 11 139 3 59 459 100 842 51 529 86 824 75 695 12 223
14
286
为了更加直观的看出显微计数法与流式计数法之间的关系,做了散点图,并对其进行线性拟合,图形如下:
流式计数法
显微计数法
图4.1 藻的显微计数和流式计数的拟合
由图4.1分析得，相关拟合数据为：
372.115895.7+=x y
644.4,18.160,3253.0,9521.0,92
->====E P F RMSE R n adj
流式计数法
显微计数法
图4.2藻的显微计数和流式计数的拟合
由图4.2分析得，相关拟合数据为：
709.32754.7+=x y
590.8,11.131,3772.0,9959.0,72
->====E P F RMSE R n adj
流式计数法
显微计数法
图4.3藻的显微计数和流式计数的拟合
由图4.3分析得，相关拟合数据为：
958.148091.7+=x y
493.1,00.95,3665.0,94.0,72
->====E P F RMSE R n adj
从上述表中数据和图形很容易可以看出,采用流式细胞术及显微镜计数法进行细胞计数,流式细胞术与显微计数的结果具有较好的线性相关性,（相关系数R 2>0.900）．对同一个样品进行计数,显微镜需要数十分钟,且计数过程中人为干
扰因素比较多,比如不同的人数的结果不同,数的区域不同结果也不尽相同,这样更容易产生误差,使得计量结果不准确；而流式细胞计数耗时低于2 min,计数工作所需时间大为缩短,且操作简单,工作量非常小[29]．
4.4 藻细胞的梯度测试
为了进一步检验流式细胞仪对藻细胞的技术的准确度,分别将藻稀释了2、4、8、16、32、64、128倍,然后取样直接上机进行检测,做了三组平行实验,所得结果如下:
表4.2 梯度稀释的藻的测定结果
藻的稀释倍数（倍） 流式细胞仪计数1 流式细胞 仪计数2 流式细胞仪计数3 流式细胞仪计数均值
标准差 相对标准偏差
1 5714 5103 5086 5301 357.7694789 0.067490941
2 2668 2495 2402 2522 134.9901231 0.053532104 4 1451 128
3 1210 1315 123.5812823 0.09400199 8 74
4 761 710 738 25.96792894
0.03517101
16 389 553 399 447 91.93475948 0.205670603 32 288 365 257 303 55.60875231 0.183325557 64 196 205 153 185 27.7908858
0.150492161
128
111
157
111
126
26.55811238 0.210222525
图4.4 藻类梯度稀释的流式细胞仪测定结果散点图
从上图表中数据和图形可以看出两个结果:一是三组平行测试的误差非常小,说明流式细胞仪测量结果的稳定性；二是每稀释二倍之后,测得的结果都会成比。