凯氏定氮法测定食品中氮含量

凯氏定氮法测定食品中氮含量
摘要:凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。

为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、氧化汞、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解,使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化。

消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化钠，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接受瓶内，硼酸接受氨后，形成四硼酸铵，然后用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。

滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。

在滴定过程中，滴定终点采用甲基红-次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定。

测定出的含氮量是样品的总氮量，其中包括有机氮和无机氮。

关键词:
1.实验部分：
1.1实验仪器及样品
1.1.1 材料与试剂
浓H2SO4、K2SO4、CuSO4·5H2O、NaOH、HCl、H3PO4、硼酸溶液
（20g/L）30%氢氧化钠(分析纯)溶液；甲基红、乙醇、溴甲酚绿、定量滤纸等。

40 %NaOH 溶液：40 g NaOH 溶于100 mL水中；
0.05 mol/LHCl标准液：4.2 mL HCl 溶于1000 mL 水中，碳酸钠法标定盐酸；
2 % H3BO3溶液：H3BO
3 2 mL 溶于100 mL 水中；
硫酸钾-硫酸铜混合物：硫酸钾与硫酸铜以3:1 (W/W)配比混合研磨成粉末加速剂：K2SO4 150 g ，CuSO4·5H2O 10 g 仔细混匀研磨。

甲基红—溴甲酚绿混合指示剂：甲基红溶于乙醇配成0.1 % 乙醇溶液，溴甲酚绿溶于乙醇配成0.5 % 乙醇溶液，两种溶液等体积混合，阴凉处保存（保存期三个月以内）。

混合指示剂：0.1%甲烯蓝乙醇溶液50ml与0.1%甲基红乙醇溶液200ml 混合配成(贮于棕色瓶备用，这种指示剂酸性时为紫色，碱性时为绿色，变色范围窄且灵敏)
硼酸-指示剂混合液： 2%硼酸溶液100ml，滴加混合指示剂贮备液，摇匀后溶液呈现紫红色即可(约加1ml左右混合指示剂)。

1.1.2 仪器
消化管、小漏斗、研钵、玻璃珠、酸式滴定管、锥形瓶、天平、凯氏定氮仪等。

凯氏烧瓶消化架吸量管(1ml, 2ml) 量筒(10ml) 凯氏定氮蒸馏装置
微量滴定管(3ml, 5ml, 可读至0.02ml) 锥形瓶(50~100ml) 容量瓶(50ml) 1.1.3样品
鸡蛋、牛奶、鱼肉、血清等含蛋白质样品
1.2实验方法
全量凯氏定氮法
样品处理：准确称取2—5g半固体样品，小心移入干燥洁净的500mL 凯氏烧瓶中，然后加入研细的硫酸铜0.5g，硫酸钾10g和浓硫酸20mL，轻轻摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜放于加有石棉网的电炉
上，小火加热，待内容物全部炭化后，泡沫完全消失后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色呈请透明后，再继续加热0.5h，取下放冷，慢慢加入20mL水。

放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。

取与处理样品相同的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。

连接装置：装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水至2/3处，加甲基红指示剂数滴及少量硫酸，以保持水呈酸性，加入数滴玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热至水沸腾。

蒸馏、吸收及滴定：向接收瓶（锥形瓶）内加入10mL20g/L硼酸溶液及混合指示剂1-2滴，并使冷凝管的下端插入液面下。

用移液管移取
10.00mL样品消化稀释液有小漏斗室流入反应室，在将10mL 400g/L氢氧
化钠溶液倒入碱液管中，提起玻璃塞使其缓缓流入反应室，并加水于小漏斗中以防止漏气。

开始蒸馏。

蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min，移动接收瓶，是冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min，然后用少量的水冲洗冷凝管下端外部。

取下接收瓶，以0.05 mol/L盐酸标准溶液滴定至由蓝色变为微红为终点，记录盐酸溶液用量。

同时吸取10.00mL空白消化液按以上操作为空白实验，记录空白试验消耗盐酸标准溶液的体积。

半微量凯氏定氮法
(1)样品处理：精密称取0.02-2.00g固体样品或2.00-5.00g半固体样品或吸取10.00-20.00mL液体样品（约相当于氮30-40mg），移入干燥的100mL 或500mL定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20mL硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°斜于于小孔的石棉网上，小心加热，待内容物全部碳化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。

取下放冷，小心加20mL水，放冷
后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。

同时做试剂空白试验。

(2)按图1-1装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水
至约三分之二处，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫
酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，
用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

1一电炉；2一水蒸气发生器(2L平底烧瓶)；3一螺旋夹；4一小玻杯及棒状玻塞；
5一反应室；6一反应室外层；7～橡皮管及螺旋夹；8一冷凝管：9一蒸馏液接收瓶
(3)向接收瓶内加入10mL 20g/L硼酸溶液及混合指示剂1-2滴，并使冷凝管下端插入液面下，吸取10.0mL样品消化稀释液，由小漏斗流入反应室，并以10mL水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞，将10mL
400g/L氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞，使其缓慢流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小烧杯中，以防漏气，夹紧螺旋夹7，开始蒸馏，蒸气通入反应室，使氨通过冷凝管而入接收瓶内，蒸馏5min，移动接收瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。

取下接收瓶，以硫酸或盐酸标准溶液（0.05moL/L）滴定至灰色或蓝紫色为终点。

同时准确吸取10mL试剂空白消化液按（3）操作。

微量凯氏定氮法
㈠消化
称取适量鱼肉样品加入50ml凯氏烧瓶(注意勿沾于瓶口或瓶颈上)。

加入硫酸钾-硫酸铜混合物约0.2克，浓硫酸3ml，小瓷片两粒，摇匀。

将烧瓶约60度角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，在通风厨内的电炉上消化。

在消化开始时，应控制火力，不要使沸液冲到瓶颈。

待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明蓝绿色为止。

消化完毕，待烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10ml (注意慢加，边加边摇)。

冷却后将瓶内容物转入50ml容量瓶，并用蒸馏水洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度摇匀，做上记号备用。

㈡蒸馏
1、仪器的洗涤：仪器应先经一般洗涤，再经水蒸气洗涤。

蒸馏器有几种，应用前需熟悉其使用方法。

使用方法如下：
图1-2 凯氏微量定氮蒸馏装置
开放自来水龙头，使水E进入G，从K管流出(水不宜开得过大以免水从G 管溢出)。

开放P3，使水进入A室，漏斗D中加蒸馏水约10ml入B室。

用拇指将管口按紧，同时开放P1，则B室中的水先从Y型管口冲出，随后A室中水经K管流出，一般情况下如此重复洗涤两次即可。

若蒸馏器内有氨存在，则应加入蒸馏水后，不加样品蒸馏一次方可使用(可用pH试纸检查)。

A为蒸气发生室，P3为其开关，P1为出水开关，B为蒸馏室，与出气管M 相接，M管插入盛有定量硼酸液的锥形瓶，B室内有Y型管，一端与A室相通，另一端经P4与漏斗D相连，可经此将样品及试剂加入B室，F为冷凝管，E为进水管，水经F、G、K而流出，蒸馏时依次在B室加入消化好的样品及NaOH, 二者反应产生氨，经M管进入锥形瓶由硼酸吸收。

2、空白蒸馏：
蒸馏器洗净后，开放水龙头P3，使水进入A室，水放至A室球部2/3即可。

取1个50ml锥形瓶，准确加入10ml硼酸-指示剂混合液，用表面皿复盖备用。

加样：用移液管吸取1ml蒸馏水，细心地由漏斗D倾入蒸馏室。

将盛有硼酸-指示剂的锥形瓶置于M管下，使管口恰好接触硼酸溶液。

用量筒从漏斗D加入30%氢氧化钠8ml，随即将P4夹紧，并往漏斗加入少量蒸馏水封闭(水封)。

蒸馏：用酒精灯加热(注意防风以维持火力恒定)，待硼酸-指示剂变绿时开始计时；3~5min后将锥形瓶放低，使导管离开液面再蒸馏2min，最后用蒸馏水冲洗导管外壁。

蒸馏完毕后取下锥形瓶，撤火，随即将蒸馏器洗净。

3、样品蒸馏：用移液管分别吸取两份1ml样品消化液，按上述操作步骤进行蒸馏(注意在加样后应用适量蒸馏水清洗漏斗)。

㈢滴定：
用0.0500N标准盐酸溶液滴定蒸馏吸收液至淡紫色或灰色，记录所用盐酸的量。

2．结果讨论
全量凯氏定氮法
2.1 凯氏定氮法原理
蛋白质是含氮有机化合物。

食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解。

分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。

然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后在以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量计算含氮量再乘以换算系数，即为蛋白质含量。

2.2 数据记录与分析
2.2.1原始数据
2.2.2可疑值弃留
实验获得的数据均合理，无可疑值。

2.2.3整理数据
精滴/mL
粗滴/mL
平行试验1 平行试验2 平行试验3 空白试验
5.90 5.30 5.50 5.60 0.45
1.计算
（V标-V0）×Ca×0.014
X = ————————————×100×K
m样/V定×V测
式中：X—样品中蛋白质含量，%；
V标—主试验（测定用液）消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL；
V
—空白试验消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL；
Ca—硫酸或盐酸标准溶液的物质的量浓度，mol/L；
0.014—氮的物质的量质量×103，g/mol；
m样—样品的质量（体积），g（mL）；
V定—消化液定容体积，mL；
V测—消化液参加测定（测定用液）的体积，mL；
K—氮换算为蛋白质的系数，蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6038，面粉为5.70，玉
米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，
肉或肉制品为6025，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日
葵为5.30。

2.结果
V标=（V1+V2+V3）/ 3 =（5.30+5.50+5.60）/ 3 = 5.47
（V标-V0）×Ca×0.014 (5.47mL-0.45mL)×0.0500mol/L×0.014 X =——————————×100×K=—————————————————m样/V定×V测 2.47g/100mL×10mL
×100×6.25=8.89%
3.结果可靠性分析
精密度
平均偏差=（0.17+0.03+0.13）/3=0.11
相对平均偏差=(0.11/5.47) ×100%=0.02%
误差分析
根据实际操作情况分析误差的产生原因：在做空白实验前可能由于定氮瓶未完全清洗干净，有之前的样液残留或者之前样液产生的氨气未排空而导致空白实验消耗的标准溶液过多，使实验结果偏低。

误差的方向性：本实验产生误差为负误差。

4.结果分析
三次平行试验均吸取10mL消化液，产生的氨气经吸收后以0.05 mol/L盐酸标准溶液滴定，消耗盐酸浓度依次为5.30mL、5.50mL、5.60mL（相对平均偏差为0.02%）。

取三者平均值5.47mL计算得样品蛋白质含量为8.89%。

由于空白实验前定氮瓶未完全清洗干净，有之前的样液残留或之前样液产生的氨气未排空导致空白实验消耗的标准溶液过多，结果偏低，产生误差为负误差。

半微量凯氏定氮法
微量凯氏定氮法
3 结论
凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出
蛋白质的含量,此法的结果称为粗蛋白质含量：由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物，如核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮
化合物.凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，
故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法[6]。

至今仍被作为标准检验方法.此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定
参考文献
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[2]〔美〕Owen R.Fennema 著王璋，许时婴，江波，杨瑞金，钟芳，麻建国译. 食品化学（Food Chemistry）第三版中国轻工业出版社:124 –226.
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[9]Alberts. B. et . al Molecular biology of the cell(3rd edition) , Garland Publishing .Inc . N. Y.1994 :27 - 86.
致谢
历时将近两个月的时间终于将这篇论文写完，在论文的写作过程中遇到了无
数的困难和障碍，都在同学和老师的帮助下度过了。

尤其要强烈感谢我的论文
指导老师—王桂芝老师，她对我进行了无私的指导和帮助，不厌其烦的帮助进
行论文的修改和改进。

另外，在校图书馆查找资料的时候，图书馆的老师也给
我提供了很多方面的支持与帮助。

在此向帮助和指导过我的各位老师表示最中
心的感谢！
感谢这篇论文所涉及到的各位学者。

本文引用了数位学者的研究文献，如果
没有各位学者的研究成果的帮助和启发，我将很难完成本篇论文的写作。

感谢我的同学和朋友，在我写论文的过程中给予我了很多你问素材，还在论
文的撰写和排版灯过程中提供热情的帮助。

论文即将完成之际，我的心情无法平静，从开始进入课题到论文的顺利完成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚
的谢意。

由于我的学术水平有限，所写论文难免有不足之处，恳请各位老师和学友批评和指正！。