纳米药物载体对人树突状细胞的影响

缩略词表
缩略语英文全称中文全称
APC Antigen Presenting Cells 抗原递呈细胞
CD Cluster of Differentiation 分化抗原簇
CTL Cytotoxic
T
Lymphocyte 细胞毒性T细胞
DC Dendritic
Cell 树突状细胞
DMSO Dimethyl
sulphoxide 二甲基亚砜
FCM Flow Cytometry 流式细胞术
FCS Fetal Calf Serum 胎牛血清
FITC Fluorescein Isothiocyanate 异硫氰酸荧光素
Flt3L FMS-like tyrosine kinase 3 Ligand 类FMS酪氨酸激酶配体
3
GM-CSF Granulocyte-Macrophage
Colony Simulating Factor 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子
HLA Human
Leukocytes
Antigen 人白细胞抗原
IFN-γ Interferon-γ干扰素-γ
IL-4 Interleuckin-－4 白细胞介素－4
MHC Major Histocompatibility Complex 主要组织相容性复合物Mo Monocyte 单核细胞
MTT 4,5-simethylthiazaoly 四甲基偶氮唑盐
MΦ Macrophage 巨噬细胞
NK Natural Killer Cell 自然杀伤细胞
PBSC Peripheral Blood Marrow Stem Cell 外周血骨髓干细胞PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cell 外周血单个核细胞PBS Phosphate Buffered Solution 磷酸盐缓冲液
PE Phycoerythrobilin 藻红素
SEM Scanning Electron Microscope 扫描电镜
TEM Transmission
Electron
Microscope
透射电镜
TNF Tumor Necrosis Factor 肿瘤坏死因子
纳米药物载体对人树突状细胞的影响
硕士研究生：马斌
导师：隋延仿教授
第四军医大学基础医学部病理学教研室，西安 710032
中文摘要
纳米技术在药物载体领域的运用催生了一大批纳米药物载体。

由于纳米粒子具有的独特性质，纳米药物载体表现出许多优异的性能和全新的功能。

现在，已经有多种纳米药物载体参与疫苗的设计与制备并取得良好效果。

纳米疫苗起效的首要因素是抗原提呈细胞（APC）对纳米药物的摄取和递呈。

虽然纳米疫苗的有效成分为抗原蛋白、多肽或编码抗原的基因，但纳米药物载体本身亦被APC摄取，此过程中可能会对APC的活性与功能产生一定影响。

纳米乳剂与纳米脂质体作为纳米药物载体都有着广泛的应用前景，我实验室已在前期研究中制备了纳米乳剂及纳米脂质体包裹肿瘤特异性抗原的肿瘤纳米疫苗，并在动物实验中取得了良好的效果。

但在进一步的研究中，我们发现纳米乳剂在动物体内可能有一定毒性，当达到一定用药量后与对照组相比，乳剂组的小鼠死亡率明显增高。

DC作为抗原递呈能力最强、唯一可诱导静止T细胞活化的APC越来越受到人们重视。

以DC为靶向的纳米疫苗药物载体已成为纳米医药领域研究的新方向，特别是在肿瘤免疫中，利用纳米药物载体将肿瘤特异性抗原靶向输送给DC，通过DC的加工将抗原肽递呈到
表面MHC-Ⅰ类分子上，激活下游的CD8+T细胞，产生针对肿瘤特异性抗原的CTL克隆，最终发挥杀伤肿瘤细胞的作用。

目前还没有文献报道纳米药物载体对人DC的毒性作用和活性影响。

本研究首先建立了人外周血单个核细胞（PBMC）来源DC和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员人外周血干细胞（PBSC）来源DC的培养方法。

在此基础上，以形态学为主要研究手段，研究了纳米乳剂及纳米脂质体在体外对人PBMC来源树突状细胞的影响。

本研究主要内容有：
1．人PBMC及PBSC来源树突状细胞的培养
目的：改进人PBMC分离培养树突状细胞的方法，以获得数量与纯度更高的树突状细胞。

建立经G-CSF动员PBSC来源DC的培养方法。

方法：利用连续贴壁法分离获得人外周血来源CD14+前体细胞，经粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白介素-4（IL-4）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导产生成熟DC。

骨髓移植健康供者在G-CSF动员4d后，Cobe Spectra TM血细胞分离机分离获得PBSC，以其为前体细胞诱导培养产生DC。

流式细胞仪（FCM）检测两种来源DC表面标志物表达水平，透射电镜(TEM)和扫描电镜（SEM）观察PBMC来源DC的形态和超微结构。

结果：连续贴壁法体外分离培养人PBMC 来源DC，所获得DC数量和纯度均高于以往一次贴壁分离培养的DC。

在GM-CSF、IL-4以及TNF-α的联合诱导培养7d后，DC高表达CD1a(44.16%)、CD40(75.04%)、HLA-DR(95.98%)、CD83(57.25)、CD86(73.20%)。

SEM观察到DC 典型形态：细胞直径多在10μm以上，表面微绒毛丰富，从胞体辐射状伸出数个粗细不等的突起。

TEM观察可见：DC胞浆内溶酶体丰富，Golgi复合体发达，还可见到粗面内质网（RER）及其周围分布的丰富的线粒体（Mit）。

细胞核不规则，常偏于一侧。

培养第15dDC还观察到明显的凋亡与吞噬现象。

经G-CSF动员PBSC诱导培养所获得DC的数量更多，5ml富集PBSC的分离液
可培养超过107个DC，PBSC来源DC诱导培养所需时间较PBMC来源DC长2-3d，培养过程中消耗更多细胞因子，所获得DC高表达CD1a(48.73%)、CD40(85.04%)、HLA-DR(91.12 %)、CD83(55.11%)和CD86(80.10%)，其表型与形态与PBMC来源DC无明显差异。

结论：在传统方法的基础上，建立了连续贴壁法分离培养PBMC来源的DC。

与传统方法相比，改进后的方法可分离培养数量较大、纯度较高的人PBMC来源DC。

同时建立了G-CSF动员及细胞分离机分离PBSC诱导培养产生DC的方法，此方法虽然培养周期较长且费用高，但获得DC数量非常多，血液其他成分浪费少，应用前景广阔。

2．纳米乳剂/纳米脂质体对DC的影响
目的：了解纳米乳剂/纳米脂质体对人DC的影响。

方法：人PBMC来源DC培养5d后，将不成熟DC分别负载不同浓度纳米乳剂/纳米脂质体，孵育48h，光镜观察DC形态变化，FCM检测DC表面分子表达，TEM观察DC摄取纳米药物载体后形态与亚细胞结构的变化。

MTT检测负载纳米微粒的DC对自体T淋巴细胞的促增殖能力。

结果：①纳米乳剂组：在1×10 5 /1ml DC中加入100μl 纳米乳剂后，光镜观察发现DC发生严重水肿，最终崩解坏死。

在1×105 /ml DC 中加入纳米乳剂20-50μl，光镜下观察DC肿胀，TEM显示大部分DC发生细胞水肿，胞内各种细胞器均发生扩张，胞核变大，水肿细胞内有脂滴样物质，部分细胞胞膜断裂甚至坏死崩解。

在1×105 /ml DC中加入10μl乳剂，光镜下细胞形态未发生明显变化，TEM仅见细胞摄取纳米乳剂后形成的吞噬溶酶体。

FCM检测显示负载10μl纳米乳剂后，DC表面CD83表达量上调。

MTT结果显示，当纳米乳剂剂量达到20μl后，DC促进T细胞增殖的能力明显下降。

②纳米脂质体组：在1×105 /ml DC中加入50或100μl的纳米脂质体后，光镜观察细胞形态变圆，表面树枝样突起减少，TEM显示DC内有大量脂质沉积，部分细胞内有胆固醇结晶，但未见细胞发生坏死或凋亡。

FCM检测显示：DC
表面分子CD83表达量未见变化，其促进T细胞增殖的能力也无明显变化。

结论：适宜剂量的纳米乳剂可作为一种药物载体被DC细胞有效吞噬摄取，并作为一种外来抗原促进DC的成熟分化。

但当1×105 /ml DC中加入的乳剂剂量超过 20μl时，DC出现水样变性甚至坏死，毒性明显。

DC对纳米脂质体的相容性明显强于纳米乳剂，在剂量达到100μl后DC仍具有良好的形态与活性。

本研究在体外条件下模拟和评价了纳米脂质体对抗原加工、处理和递呈具有关键作用的DC的毒性和活性的影响，结果以纳米脂质体作为抗原载体对DC是无毒性的，活性亦无影响，此为纳米脂质体肿瘤疫苗的研发提供了重要的实验基依据。

关键词：纳米乳剂，纳米脂质体，树突状细胞，电镜
The influence of nanoemusion /nanoliposome on
DC
Candidate: Ma bin
Supervisor: Prof. Sui Yan Fang
Department of Pathology, School of Basic Medicine, Fourth Military
Medical University,Xi’an 710032, China
Abstract
A great deal of drug nano-carriers have been produced by use of nanotechnology. Nano-carriers have many excellent characters and new functions because of the particular properties of nano-particles. Nowadays, many kinds of drug nano-carriers have been used to design and produce tumor vaccines successively.
In order to make nano-vaccine work effectively, drug nano-carriers must be intaken and presented by antigen presenting cells (APC) as first steps. Although the antigen proteins, peptides, antigen-encoding genes are the effective components of nano-vaccines, drug nano-carriers are also intaken by APC. During this process, the activity and function of APC may be affected because of drug nano-carriers itself. The application of nanoemusion and nanoliposomes as drug nano-carriers is to have prosperous future. Workmates in our lab have prepared tumor specific antigen enwrapped by nanoemusion and nanoliposomes
respectively, both of which manifest sound effect in animal experiment. By the following assays in vivo, we found that over-loaded nanoemusion as a carrier is toxic to mice. As the nanoemusion beyond a certain level is injected to mice, the death rate of treatment group is high than the death rate of contral group. Dendritic cells (DC) are the most potent professional antigen presenting cells and the exclusive cells which can activate the resting T cells. The drug delivery system of nano-vaccine tagetting DC is to be a new study direction in the nanomedicine field. The reseach about toxicity and activity of drug nano-carriers to human DC has not been reported by far. We established the methods to culture DC from human peripheral blood mononuclear cells and peripheral blood stem cells in vitro. Then we discuss the influence of nanoemusion and nanoliposomes to DC from PBMC. By these experiments we lay a solid foundation for the in-vivo reseach of nano-vaccine targeting DC.
1Culturing dendritic cells from human peripheral blood mononuclear cells and human peripheral blood stem cells.
Objective: To improve the method of isolated cultivation of dendritic cells from the peripheral blood mononuclear cells, and get comparatively large amount of DC with high purity. To establish the method of culturing dendritic cells from the peripheral blood stem cells which is released into peripheral blood by G-CSF mobilization. Methods: Utilizing successive adherence method to obtain CD14+ precursor cells. The mature DC was induced in vitro by granuloeyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF), interleukin-4(IL-4) and tumor necrosis factor -α(TNF–α ). The marrow cells of healthy donors are mobilized by granuloeyte colony-stimulating factor (G-CSF). After four days, harvesting peripheral blood
stem cell with Cobe Spectra TM blood collection machine as the precursory cells of dendritic cells. Determining the expression level of several DC surface markers by flow cytometry. Observing the morphological features and subcellular structure of dendritic cells from PBMC with transmission electron microscope (TEM) and scan electron microscope(SEM). Results: The quantity and purity of DC isolated from human PBMC with successive adherence method is more satisfactory than that of DC isolated with traditional one-time adherence method .We obtained 0.5~1×107 DC from 108 PBMC with successive adherence method, and the purity of obtained DC is over 80%. The DC cultured 1 week highly expresses CD1a(44.16%), CD40(75.04%), HLA-DR(95.98 %), CD83(57.25) and CD86(73.20%). It is observed by SEM that the shape of DC is irregular: circular, oval, diamond or polygonal etc. The diameter of DC body is over 10μm. Tiny villus is enriched in the surface. Numerous dendrites protrude radially from cell bodies, some of which are as long as 2 or 3 times of cell bodies, and the dendrites cross and fuse each other. Many protrusions adhere to the flask bottom and cell bodies suspend. We observed the subcellular structure of dendritic cells in different phases with TEM: the shape of nuclei is irregular : kidney-shaped, oval, U-shaped. Most nuclei locate unsymmetrically. Euchromatin is predominant and heterochromatin can hardly be seen. Nuclear membranes are clear and nucleoli can easily be found. There are abundant lysosomes and developed Golgi complex in the cytoplasm of DC from PBMC and affluent chondrosomes surrounding RER. Apoptosis and phagotrophy can be detected obviously on the 15th day in cultured DC. More DC can be obtained from PBSC after G-CSF administration. At least 107 DC can be harvested from 5ml
separating medium containing large amount of PBSC. Longer period ( 9 days ) and more cytokines are needed in the culturing of DC from PBSC compared with those from PBMC.The phenotype and morphological features of DC from PBSC are similar with those from PBMC and certain surface markers are also highly expressed in DC from PBSC, of which CD1a(48.73%), CD40(85.04%), HLA-DR(91.12 %), CD83(55.11%) and CD86(80.10%). Conclusion: We set up successive adherence method to isolate and culture DC from PBMC by which we get more DC with high purity.Meanwhile, we set up the method to isolate and culture DC from PBSC which is harvested by Cobe Spectra TM blood collection machine after G-CSF administration. By this method we get larger amount of DC and waste fewer components of blood other than DC. After all we consider that the application of DC from PBSC has prosperous future.
2．The influence of nanoemusion /nanoliposome on DC
Objective: To determine the toxicity and activity of nanoemusion /nanoliposome on DC from human PBMC. Method: After culturing of 5 days, immature DC from human PBMC was loaded with different dose of nanoemusion /nanoliposome and then incubated for another 48 hours. The morphological changes of DC were observed by optics microscope. Detecting the expression level of DC surface marker by flow cytometry. Observing the morphological and subcellular structur changes of dendritic cells loaded with nanoemusion/nanoliposome by TEM and SEM. MTT assay was applied to determine the capability of DC loaded with nanoemusion/nanoliposome stimulating proliferation of T lymphocyte respectively. Results：①Nanoemusion group: After 100μl nanoemusion was added into 1×10 5/ml DC, severe swelling,
disaggregation and necrosis of DC was detected by optics microscope progressively. After 20μl, 30μl or 50μl nanoemusion was added into 1×10 5/ml DC, cellular swelling was detected by optics microscope and cell organelles engorgement and nuclei enlargement took place. There are many lipid-droplet in the swelling cells. Cell menbrane of little amount of DC collapsed and disaggregation and necrosis of DC were detected seldomly. After 10μl nanoemusion was added into 1×105/ml DC, cell shape remained still and phagolysosomes enwrapping nanoemusion was found by TEM. The expression level of DC surface marker CD83 was up-regulated in the DC loaded with 10μl nanoemusion. The result of MTT assay showed that the capability of DC stimulating proliferation of T lymphocyte descended obviously. ② Nanoliposome groups: After 50-100μl nanoliposome was added into 1×10 5/ml DC, the shape of DC became circular and the amount of surface protuberances on DC membrane decreased. Lipidoses and intracellular cholesterol crystal can be found in endochylema of DC notably by TEM. But necrosis and apoptosis were not found in DC of this group. The expression level of DC surface marker CD83 remained still by FCM. The MTT assay manifests that the capability of DC stimulating proliferation of T lymphocyte is not different from the contral group. Conclusions: nanoemusion with proper dose can be used as a drug carrier efficiently intaken by DC and can promote DC maturation and differentiation. But cellular swelling and necrosis appears as nanoemusion with volume more than 20μl is added into 1×105 /ml DC, showing that excessive nanoemusion is toxic to DC. The morphological feature and activity of DC loaded with 100μl nanoliposome is not affected obviously, suggesting that naoliposome is more tolerable to DC than
nanoemusion.
In the first part of experiment, we established the successive adherence method to culture DC from PBMC and cultured DC from PBSC which is harvested by blood collection machine following G-CSF administration. We found that DC from PBMC and PBSC have typical molecular phenotype and morphological feature, normal ultrastructure and function. In the second part of experiment, we testified that toxicity and influence on DC activity of nanoemusion are more severe than to DC than that of nanoliposome. It suggests that the mechanism of DC swelling may be associated with surface acting agent in nanoemusion (further investigation is needed to testify this conclusion). Nanoliposome is almost non-toxic to DC and has no effect on DC activity differing from nanoemusion. With these findings, we can conduct further investigation on tumor vaccine based on nanoliposome targeting DC.
[KEY WORD] Nanoemusion，Nanoliposome; Dendritic cells; Electron microscope
前 言
纳米技术(nanotechnology)是以0.1~100nm尺度的物质或结构为研究对象的学科，主要包含纳米材料学、纳米化学、纳米机械学、纳米电子学、纳米医学等。

纳米技术在药学领域有着广泛的应用前景。

纳米药物载体的发展，为现代给药系统的研究提供了新途径，对现代药剂学的发展提供了机遇。

运用纳米技术，人们可以制备纳米药物存储器，做到药物的定点定量释放，可以制造纳米生物导弹，直接作用到靶向部位或者靶向细胞。

由于树突状细胞（dendritic cell）是体内功能最强的、唯一可诱导静止T 细胞活化的抗原递呈细胞，参与抗原的识别、加工处理与递呈，是免疫反应中识别自我与非我的重要环节，因此一些研究者都开始将纳米药物的靶向细胞锁定为DC，通过纳米药物载体将各种药物靶向输送给DC，以激发DC在免疫治疗中的关键作用。

我实验室将纳米药物载体技术与肿瘤免疫结合，在国家自然科学基金的资助下，设计在纳米粒子表面修饰DEC205抗体靶向小鼠树突状细胞，以增强树突状细胞对肿瘤抗原的递呈效率。

相信在不久的将来会有安全、高效可主动靶向DC的纳米药物载体问世。

文献回顾
第一部分纳米药物载体
纳米科学技术是二十世纪八十年代末诞生并蓬勃发展起来的一种高新技术。

纳米技术在生物医学领域的运用诞生了纳米生物学和纳米医学，两者密切相关，前者是后者的基础。

纳米技术在药物载体领域的运用诞生了一大批纳米药物载体。

由于纳米粒子具有的独特性质，纳米药物载体表现出许多优异的性能和全新的功能，在众多疾病治疗领域展现出广阔的应用前景[1，2]。

纳米药物载体与传统药物载体相比有诸多优点。

纳米药物载体即可以运送传统小分子药物，也可运送高分子量的生物制剂，如蛋白、多肽和DNA分子[3]。

纳米药物载体可以用来针对组织或器官的靶向性给药；提高口服药物的生物利用率及药效；提高基因药物的稳定性；防止生物制剂被核酸酶和蛋白酶降解。

由于载体具有的亚微米结构，用他们运送药物有很多优点。

纳米微粒可以轻易穿过细胞间隙和上皮屏障，明显提高药物的细胞摄取率，从而增进体内用药的靶向性和高效性。

通过改变载体的组成，人们可以控制药物的释放速度，靶器官的药物浓度，从而达到最佳治疗效果[4]
一纳米药物载体的分类
1 磁性纳米球
纳米磁性颗粒指具有顺磁性或超顺磁性的纳米铁氧体微粒作为药物载体
注入到人体内,在外加磁场作用下,通过纳米磁性粒子的磁性导向性,使其向病变部位移动,从而达到定向治疗的目的。

例如10～50nm的Fe3O4的磁性粒子表面包裹甲基丙烯酸,尺寸约为200nm,这种亚微米级的粒子携带蛋白、抗体和药物可以用于癌症的诊断和治疗[5]。

2 生物可降解高分子纳米微粒
高分子生物降解性药物载体或基因载体，通过降解，载体与药物或基因片段定向进入靶细胞后，表面的载体被生物降解，芯部的药物释放出来发挥疗效[6]。

目前研究中使用的高分子生物材料包括聚丙交脂（PLA）、聚乙交脂（PGA）、聚乙内脂（PCL）、聚苯乙烯（PS）、纤维素、纤维素-聚乙烯、聚羟基丙酸脂、明胶以及它们之间的共聚物和生物性高分子物质，如蛋白质、磷脂、糖蛋白、胶原蛋白等[7]，利用它们的亲和力与基因片段和药物结合形成生物高分子纳米颗粒，再结合上具有定向功能的识别分子，靶向性与目标细胞表面的配体结合后将药物送进靶细胞，达到杀死肿瘤细胞或使肿瘤细胞发生基因转染的目的。

3 纳米乳剂
纳米乳剂是一种粒径小于100 nm的乳剂。

由于纳米粒子具有的特殊效应，纳米乳剂具有与传统乳剂完全不同的特性，因而具有了很多新的用途。

纳米乳剂是两种不互溶的液体形成的热力学稳定的、各向同性的、外观透明或半透明的分散体系，微观上由表面活性剂界面膜所稳定的一种或两种液体的微滴所构成。

纳米乳剂由油相、水相、表面活性剂和助表面活性剂（一般为中等链长的醇）四部分组成，从结构上可分为水包油型(O/W),油包水型(W/O)及双连续型（图A）。

其中油包水型纳米乳剂可以用作水溶性药物的载体，水包油型纳米乳剂可以用作脂溶性药物的载体，把药物制成纳米乳剂制
剂可以增加药物的稳定性，提高药效，降低药物的毒副作用[8、9]。

图A 纳米乳剂的结构（a）水包油（b）双连续（c）油包水
表面活性剂是一种能大大降低溶剂（通常为水）表面张力（或液-液界面张力），改变体系的表面状态从而产生润湿和反润湿、乳化和破乳、分散和凝聚、起泡和消泡以及增溶等一系列作用的化学物质[10]。

表面活性剂分子是一种既亲油又亲水的两亲分子。

由于表面活性剂分子的这种分子结构，其分子具有一部分可溶于水而另一部分易自水中逃离的双重性质，这使得表面活性剂分子必须定向排列才能稳定存在。

这种情况使表面活性剂体系具有两个重要性质，一是表面活性剂分子在溶液表面的定向吸附，二是在溶液内部形成胶束[11]。

纳米乳剂的形成一般都需要加入助表面活性剂，助表面活性剂在纳米乳剂中主要起如下作用：(1)协调表面活性剂，降低界面张力；(2)增加界面流动性，减少纳米乳剂形成时的界面弯曲能，使纳米乳剂自发形成；(3)调节表面活性剂的亲水亲油平衡值（HLB），使表面活性剂在油-水界面上有较大的吸附。

常用的助表面活性剂有低级醇、有机胺、烷基酸、单双烷基酸甘油酯以及聚氧乙烯甘油酸酯等[12]。

近20年来，纳米乳剂在药物制剂中作为药物释放介质引起人们很大兴趣。

由于纳米乳剂中不同极性微域的存在，使它既可以作为疏水性药物的载体，也可以作为水溶性药物的载体，疏水性药物分布在非极性微区中或吸附
在表面活性剂定向吸附层的疏水部位；而水溶性药物则分布于水区之中。

此外还可作为油水难溶性药物的载体[13]。

纳米乳剂可用于各种途径给药。

低黏度纳米乳剂，适用于口服、注射、非胃肠道、肺部及眼部给药等；高黏度纳米乳剂则适用于皮肤给药[14]。

4 脂质体
脂质体（liposome,又称之为脂小球），是由磷脂双层膜构成的中空小球。

构成脂质体的主要成分是磷脂和其他类脂化合物，脂质体是以磷脂和其他两性化合物分散在水中时形成的有序排列的囊泡结构。

脂质体是一种定向药物载体，属于靶向给药系统的一种新剂型。

脂质体可以包裹脂溶性和水溶性两类药物，具有如下特点：
（1）制备工艺简单，一般药物都较容易包封在脂质体中。

（2）水溶性和脂溶性两类药物都可包裹在同一脂质体中，药物的包封率主要与药物本身的脂水分配系数及膜材性质有关。

（3）脂质体本身对人体毒性小，并且脂质体对人体无免疫抑制作用。

（4）脂质体静脉给药时，离开血管进入细胞间质的机会很小，经皮下或腹腔注射的脂质体主要进入局部淋巴结中，只有粒径较小的脂质体才从肝等器官的不连续血管的窦状隙进入细胞间质。

进入体内的脂质体主要被网状内皮系统的巨噬细胞和血中的单核细胞吞噬。

（5）脂质体制剂能够降低药物的消除速率，延长药物作用时间，增加药物的体内外稳定性[15]。

（6）可以制成免疫脂质体，根据靶分子特性将质脂体运送到特定的组织中，与抗体或受体作用释放药物。

5 脂质体与纳米乳剂的区别：
(1)脂质体和纳米乳剂的制备方法不同,脂质体的制备有:混溶法、PH梯度法、被动包埋法、嵌入法等[16]，纳米乳剂一般是先将油相与表面活性剂和助表面活性剂混合，再加水滴定来制备。

(2) 径粒大小不同，脂质体根据其所包含的双层磷脂膜层数可分为单室脂质体和多室脂质体，含有单层双层磷脂膜的囊泡称为单室脂质体，含有多层双层磷脂膜的囊泡称为多室脂质体，一般小单室脂质体径粒小于200nm，大单室脂质体径粒在200~1000nm之间，多室脂质体的径粒在1µm~5µm之间。

纳米乳剂的径粒在10~100nm之间，范围窄，一般比脂质体径粒小。

(3) 脂质体是多层囊泡,囊泡中央和各层之间被水相隔开。

纳米乳剂是由单层表面活性剂把油相和水相分散在一起。

脂质体是通过表面修饰使之具有靶向性、可控缓释性、及其他可控性能,纳米乳剂是包裹在表面活性剂中以达到透皮吸收、靶向给药等。

(4) 脂质体是磷脂分散在水中形成的多层囊泡,纳米乳剂可以用磷脂作表面活性剂,也可以用其他的离子型表面活性剂,非离子型表面活性剂和混合表面活性剂。

并且,纳米乳剂一般还须加入助表面活性剂才可以自发形成。

二纳米载药微粒可以改变药物的胞内转运途径
纳米药物载体可以改变药物的胞内代谢。

有研究者研究了血管平滑肌细胞和血管内皮细胞对纳米微粒的摄取和转运[17，18]。

这些结果显示细胞摄取纳米微粒有以下几种途径：吞噬作用、液相泡饮作用和受体介导细胞内吞作用[19]。

数据表明纳米微粒与细胞共育10分钟后，即有微粒脱离整合体进入胞浆。

透射电子显微镜观察发现，细胞与纳米微粒共育后，微粒与胞内的泡膜
相互作用，从而使吞噬小泡局部膜不稳定而导致微粒释放[20]。

纳米微粒还可以改变药物的胞内定位。

纳米微粒的表面性质可随环境PH 值的变化而变化，例如在PH=7时为阴离子，这种微粒易从核内体逃离进入胞浆。

在PH=4时为阳离子，在酸性条件下表面性质不发生变化的微粒则保留在核内体中。

因此，改变纳米微粒表面性质，研究者就可以决定纳米微粒在细胞器内的定位。

纳米微粒的一些重要物理参数如粒径、表面状态、亲水性都可以通过改变制备工艺和表面性质来控制，从而改变微粒的释药特性。

还有研究者将组织特异性定位信号如核定位信号（NLS）修饰到微粒表面，使微粒靶向定位到细胞核，可以明显提高纳米微粒作为DNA载体的效率[21]。

因此纳米微粒可以作为一种具有胞内靶向性的有效载体。

三纳米药物载体的靶向性
药物靶向性是指药物能高选择性地分布于作用对象,从而增强疗效、减少副作用。

纳米药物能克服药物在体内输送过程中所遇到的各种生理屏障，将药物送到一定的靶位[22]。

控制纳米药物载体的尺寸，可克服体内的“物理屏障”，使药物有针对性地输送到靶器官或组织的毛细血管中，并透过毛细血管上的空隙进入组织或器官内。

利用纳米药物载体表面积大、界面活性高的特点，对其表面进行改性，可避免被体内的免疫系统识别、吞噬，克服体内的“生物屏障”。

另外，血液于一些脏器间往往存在致密的“物理屏障”，如“血脑屏障”、“血液-胎盘屏障”、“血液-骨髓屏障”和“血液-睾丸屏障”等。

纳米药物载体可以穿越以上屏障，提高药物的投送率[23]。

依据纳米药物载体靶向性的性质，可分为：
（1）被动靶向性。