丁香园膜片钳技术讨论区资料汇编
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
丁香园膜片钳技术讨论区
资料汇编
整理人:xiaoxuanzi
发起人:tianx775
2006年6月
目录
第一节膜片钳技术介绍 (1)
应用 (1)
基本概念 (2)
第二节仪器操作和维护 (3)
仪器的使用 (3)
噪声 (4)
玻璃微电极的制备 (5)
第三节实验操作 (7)
1.细胞的分离、培养 (7)
(1)心肌细胞 (7)
(2)平滑肌细胞 (17)
(3)其他细胞 (19)
2.电极的拉制与电镀 (23)
3.电极内外液与渗透压 (25)
4.串联、封接、电极电阻 (28)
5.补偿 (37)
6.刺激方案 (40)
7.动作电位记录 (42)
8.电流记录 (42)
(1)钙电流 (42)
(2)钾电流 (45)
(3)钠电流 (47)
(4)其他电流 (48)
9.穿孔 (50)
10.单通道记录 (51)
11.脑片 (54)
12.数据分析与处理 (55)
第四节 相关电子文献及书籍 (61)
第一节 膜片钳技术介绍
一、应用
1.全细胞记录技术的应用
[Cactuswzw](1)离子通道宏观性质的分析,例如,离子通道的性质和分类(电压门控通道、膜受体激活通道、配体门控通道、胞内第二信使激活通道等)
(2)离子通道微观性质分析,例如单一离子通道活动的测定的测定,离子通道的构造,分布和机能的分析等。
(3)膜电容的测量及其对细胞分泌活动的研究。
(4)胞内钙离子浓度和钙通道电流的同时定量检测。
(5)组织切片的全细胞记录。
(6)植物细胞的电生理研究。
二、基本概念
1.刚刚接触patch,有些概念都很模糊
holding potential与command potential?
Axon200B的放大器控制面板上有ext. command,又是什么东东?
都分别什么时候给予?
在我理解,pipette capacity compesation就是快电容补偿,而Cm补
偿为慢电容补偿,那为何Axon200B的面板上在pipette capacitance compensation下面列了FAST和SLOW的magnitude以及时间常数的调节
扭?
[baxiansheng]Holding potential 是钳制电压,这是实验中从头至尾
通过电极用于钳制细胞的一个电压,和膜电位的关系取决于采用的实验
模式。
而command voltage是在holding potential基础上施加的刺激方
案,比如全细胞实验中可以设置Holding potential在-80mV,然后去极
化至+10mV 400ms,那么这个去极化至+10mV的方波就是command
voltage,当然command voltage的设置可以根据实验设置得更复杂。
Axon200B放大器控制面板的ext. command是用于接外接刺激器的,通过
外接刺激器来施加command voltage,当然现在完全由计算机代替了。
pipette capacity是电极电容,因为时间常数小,所以称快电容,而Cm
是膜电容,因为时间常数大,所以称为慢电容。
Axon200B的面板上在
pipette capacitance compensation下面列了FAST和SLOW的magnitude
以及时间常数的调节扭,那是对电极电容的补偿方式。
实际上电极电容
中也有一些时间常数较大的成分,单纯补偿FAST效果并不完美,需要再
稍稍调节一下SLOW。
2.我的课题是关于心血管系统中离子通道方面的研究。
离子通道一般有备
用关闭状态(close),激活状态(active)和失活状态(inavtive)。
但
最近我看文献有去激活状态,英文为deactivation,我想跟失活肯定不是
一个概念,但又找不到确切的含义,有谁能帮我解释一下这几种通道状
态个代表什么含义?
[coolworm]C<----->O<------->I
这里,C: 关闭
O:开放
I:失活
激活(activation:从C到O的过程。
失活(inavtivation):从O到I的过程。
去激活(deactivation):I 回到C的过程。
3.请问,有没有人知道,电压钳和电流钳的区别,电流钳的英文是不是
current-clamp?多谢!
[xuji007] 电压钳应该就是钳制住电压来测电流,电流钳就是钳制住电流来测电压。
电流钳就是current-clamp。
4.请教整流的定义,以及内向整流、外向整流的区别,我只知整流是一种
电学特性,并且成为诸如钾通道分类的标准,但对上述确切含义还很模糊,请高手赐教!
[xuji007]我不是高手,只是谈谈自己的理解。
如果膜只是一个单纯的电阻的话,那么通过它的电流就应该和电压是线性的关系。
但由于通道的存在,这种线性关系就会被改变。
比如Ik1,它的电流随电压增大的趋势会随着电压的增大而逐渐减弱,也就是内向整流了。
还请高手之指正。
[dingyinyuan]所谓整流一般是相对离子通道电流的电压依赖性的线性关系而言,内向整流指离子通道电流随电压的升高而降低,I-V曲线位于相对偏向下。
如心肌细胞IK1 。
外向整流指离子通道电流随电压的升高而更高超过电压依赖性的线性关系电流值,I-V曲线位于相对偏向上。
[心潮澎湃]依据欧姆定律:R=U/I,若U增大,但是I不是按比例增大,即为整流。
若U增大,I增大的幅度减小,I-V曲线向下弯曲,则为内向整流,如IK1的部分外向电流,反之,如U增大,I增大的幅度增加,I-V曲线向上弯曲,则为外向整流,如ITO电流,整流与除极和复极有一定联系。
[baxiansheng]rectifying “整流”,是借用物理电子学的一个概念,大家都知道“整流二极管”,在一个方向电阻非常小,反向电阻非常大。
在通道电流中,是指这种通道的电流在一个方向上的电导(电阻的倒数)大,而反方向的电导小。
比如内向整流钾电流,是指电流内流时电导较小,外流时电导较大,在I-V曲线上不呈直线,而是零电流以上的部分斜率下降,呈抛物线状,亦及电导G=I/V变小(在通道电生理中,一般外向电流为正)。
在钾通道中,很多电流具有整流特性,比如乙酰胆碱敏感钾电流,ATP敏感电流等等。
delayed rectifying k+ channel 延迟整流钾通道,是特指的一种钾电流通道,在豚鼠上有表达,而在大鼠上几乎没有。
它具有整流的特性。
而且这个通道只具有激活们而没有失活门,当去极化激活后,电流不会象钠电流、钙电流、瞬时外向钾电流等随时间延长又自动失活,这大概就是它delayed的含义。
这个电流含有快成分和慢成分两种。
不知这样解释是否明白。
第二节 仪器操作和维护
一、仪器的使用
1.各位高手,本实验室刚买的一套设备, 膜片钳放大器是Axopatch 200B,采集卡是 digitizer 1200 ,软件是Axon公司的Pclamp 8.0,请问各位有没有使用相似设备的,能把你们放大器和采集卡interface的线路连接告诉我吗?
还有,我们的微操纵器是***的液压的,那个架子是怎么安装到显微镜上面去的?
[chianhuu]其实那么多接口,用到的并不多。
信号线是使用BNC线将放大器的scaled output连接信号器的 ANALOG IN 任意接口,这是采集信号。
将 放大器的 COMMAND INPUT(任意,分别对应于面板上两个旋钮,根据需要连接)连接信号器的 ANALOG OUT 1或2 。
HEADSTAGE 接电极HEAD。
最好能将放大器上的SIGNAL GROUND 和整台机器的公共接地端连接,抗干扰。
放大器连接电脑的接口用DIGITAL BOARD 。
其他的就不用了。
2.我看了几个单位的PATCH ,他们都没有要外加的刺激器和示波器.仅有PATCH CLAMP(AXONPATCH200和A/D(1322A)转换卡.我们想PATCH CLAMP 里有方波刺激,电脑显示屏能代替示波器.于是我们也参照他们的线路联接.结果就是不能正常地测电阻.
谁能告诉我们AXONPATCH200B和A/D1322转换器正确的连接线路吗?
1, 由PATCH CLAMP 和A/D组成的如何连接
2. 由PATCH CLAMP 和A/D以及示波器组成的连线.
[yangk2002](1),要不要刺激器,取决于实验设计。
如果只需要通过电极细胞内刺激,当然不需要刺激器。
而如果需要在细胞外产生刺激(例如刺激突触前递质分泌),则非用不可;
(2)示波器显示变化比电脑快,有的实验室还用。
这是各人习惯问题,有
人说用示波器“太土”,是一种不了解情况的说法;
(3)接线方法有二:彻底搞清法(费时,但对今后有好处):仔细对照软件
使用指南,上面有详细说明;囫囵吞枣法(省事,立即可用):照猫画虎,看别人的连接方法,然后拷贝别人的程序,保证可以运行。
是为抛砖引玉。
3.膜片钳采集软件Clampex的Acquisition Mode中Fixed-Length Events Mode和Variable-Length Events Mode是如何采样的?他们有何区别?
主要用于那种实验?
[刘振伟]Fixed-Length Events Mode用于诱发突触活动、动作电位等时间长度固定的信号采集。
在设定阈值的情况下,对阈上事件进行采样,对每个阈上事件的记录时间长度是固定的,但总的采集时间被记录下来。
记录也可受控于外部触发命令。
Variable-Length Events Mode用于通道关闭时间较长(静止期较长)的单通道记录。
在设定阈值的情况下,只对阈上事件进行采样,而对没有阈上事件发生的“静止期”则不采样,从而减小了所记录数据文件的容量。
4.请问,各位,我们用的200B的放大器,为什么总是超载呢?是软件设置的问题,还是硬件的问题(急)谢谢
[upboom]我用的也是200B,以前我也碰到过overload的情况,提供几个方面的原因供你参考:
(1)保证电极拉制质量,没有断头、过粗现象。
(2)holder和参比电极的银丝要镀得均匀,时间过久则需要重新镀银。
(3)接地良好。
(4)细胞外液、电极内液配制合理,渗透压、PH保证在正常范围内,并用
滤膜过滤去除杂质细菌。
(5)入水后适当调节液接电位(我的offset值就调在4~5之间),如果是
这方面原因,那么肯定会恢复正常的。
二、噪声
1.我们用的是CEZ-2400型膜片钳放大器(NIHON KOHDENO,Japen)放大,
是血细胞做的,接地还可以,以前他们一直是这么做的,可是我放大
以后才发现干扰电流幅度在2~6pA左右,基本把我作出的电流淹没了。
[sbboy1973]你要首先确定你的G欧封接是否成功?依我个人经验电极
电阻一般在7-10较合适,等你G欧封接成功后噪声会大大降低;
2,滤波要打在1KHz,不要太高;
3,放大一般在20-50倍即可,但还要根据你测定的通道电流大小决定;
4,要大大降低噪声,还是要很好的接地、很好的屏蔽(最要注意的是
显微镜)、最好在晚上做,其中屏蔽尤其要注意那些电线、插头,可以
用排除法慢慢试,要有耐心。
[changqingent]如果你能够按照楼上的方法妥善解决噪音问题(但我
个人认为这个可能性不大,因为你们实验室已经完好的运转了很长时
间),你尝试将放大器增益增大。
如果还不行,那只有换实验室(放大
器)或者课题(全细胞模式)
[changqingent]我个人认为膜片钳实验封接过程中,防震台非常重要,
电极抖动主要与台子有关,而与橡皮管关系不大。
橡皮管的长度与粗细
和封接的难易有较大关系,应该是越近holder时,管径越细,且管子不
应该太长。
如果太长,给的负压就更易分散(相当于表面积大,单位负
压就很小)。
我们实验室用的是一种硅胶管,从老师德国带回来的,不
过我见过其它实验室用一般的硅胶管做DRG细胞,也挺好的。
Good luck!
2.屏蔽网、微操、防震台以及屏蔽笼内其他设备通过地线集线器连于放
大器的SIGNAL GND,另外埋设了一根专用地线,是否要将SIGNAL GND
与专用地线相连?SIGNAL GND和仪器的电源地实际是相通的,如果将
SIGNAL GND与专用地线相连,是否会导致多点接地,引起环路干扰?
正确的接地方法应该怎样接?
[baxiansheng]Axon的200B的SIGNAL GND和仪器的电源地是不相通的。
也有些牌子的放大器两者之间提供了一个连接片,连与不连供自己选
择。
看来,在减低干扰上,专家们也对SIGNAL GND和仪器的电源地是否
应该相导通,没有统一意见。
请教过一些电学专家,说地线只对50Hz之类的较低频干扰效果较好,
而对于高频干扰没什么效果。
你可以先比较一下SIGNAL GND与专用地线
连与不连时,干扰的情况怎么样。
如果连上差别不大,甚至干扰更大(我
们实验室就是这样,可能引入了环路干扰),就不必连了。
因为很多建筑的电源地是比较马虎的,你还可以不用电源地(电源三相
插头的地线不连上),而只用专用地线试一试,看看效果是不是更好。
三、玻璃微电极的制备
1.请教大家一个问题,也许是很傻的问题,但我不懂,希望知者不辞劳苦给予解答。
膜片钳用的电极分两步拉制。
请问拉出来的两个电极是一样的吗?我们
拉出来的都不一样。
如果应该是这样的话,那上面和下面的两个电极哪
一个口径粗,哪个口径细?两个都能用吗?还有,如果一拉设置在
13.50,那二拉的参数越小应该拉出来的口径越大,对吧?但是如果想
同时调节一拉和二拉的参数,怎么样才能得到理想口径的电极呢?我们
拉出来的电极的口径偏大,请问能不能提供一个好的参数?
拜托了!先谢了!
[zhangyu]电极得拉制要根据你实验得目的去定,拉制参数越高口径越
小,阻抗就越大,这在电脑上有显示得。
一般电极尖端充液后得阻抗
在1-5M欧左右即可。
可以根据实验得结果,封接好不好调整参数。
2.我想问一下有经验的各位老师,电极拉制时想让电极尖端后面的肚子胖些,应该怎样调整参数,两步拉制仪,当尖端大小合适时是不是应该把
拉力增大才会让它胖起来呢 ?
[baxiansheng]把第一步拉的长度调短一些,拉力增大一些。
如果口径
大了,再把第二步温度调高些。
3.我想使用的是南京六合生产的外径是1.5或1.8mm的玻璃毛坯管来拉制膜片钳电极, 但是我试了很久都没有找到合适的拉制程序.
有哪位高手使用的是SUTTER公司的P-97拉制仪,或者NARISHIGE公司
的PC-10拉制仪,可以告知一下拉制程序怎么设置吗?谢谢!
[dairiver]我使用的是南京六合生产的外径 1.5mm的玻璃毛坯
管,NARISHIGE公司的PC-10拉制仪,设置为两步拉制,第一步93度,第二
步67度,电极电阻一般为3-7兆.你可以试试.
4.我使用SUTTER公司的P-97拉制仪,南京六合生产的外径是1.6mm的玻璃毛坯管来拉制玻璃微电极,拉制程序如下:
1)heat=RAMP+20 pull=15 velocity=75 time=150
2)heat=RAMP+20 pull=15 velocity=75 time=150
3)heat=RAMP pull=20 velocity=80 time=100
但是玻璃微电极的电阻只有0.2M欧。
我想拉制1~2M欧的玻璃微电极进行细胞外记录,请教各位高手如何设
置P-97拉制仪的拉制程序?非常感谢!
[chianhuu]你好 ,你所使用的程序是用来拉微电极(Microelectrode)
的,不是来拉膜片钳电极的。
拉膜片钳电极的时候,要把Pull=0,而
后调节velocity,一般80左右,loop是1次。
一般1次就可以了。
但
是sutter的说明书上说要3次的最好,照说明书调就可以了。
我用heat=RAMP+15 pull=0 velocity=80 time=200
一般都在3-5之间。
5.有谁用过多管拉制仪,麻烦介绍几种。
[barrywl]多管电极拉制仪介绍
多管电极拉制仪(PV-4型,日本Narishige)为半自动电极拉制仪。
需要设定的参数有:
HEATER:加热强度(10-15A)λ
MORTOR:锁套旋转速度(使电极扭曲)λ
三管给药电极制作:
选用外径1.5mm,内径0.88mm,长度120mm的带芯玻璃电极毛胚,用胶布将3根捆绑在一起,上端固定于锁套,下端挂重物,调节旋纽(上下,前后,左右)使电极位于加热圈中心点,开电源,调节加热强度和锁套旋转速度,当电极变软后,稍加固定砝码,使电极扭成麻花状,直至断开,迅速下调加热丝,关闭电源。
显微镜下观察,各管开口均匀平齐者用于实验。
每根玻璃管尖端开口8~12 μm。
其中一管用于固定,其余管折出45度角,用于装药液。
6.用NARISHIGE的抛光仪,那么一般离电阻丝多远呢,多长时间,电流大小?
[samnj]玻璃电极抛光在显微抛光仪或其它类似设备上进行时以400-800倍的放大率观查电极尖端。
热源通常是铂丝或铂-铱丝,为了防止金属蒸发到玻璃电极上,热丝通常在与玻璃电极靠近的点涂敷玻璃。
由于玻璃电极尖端的开口刚好在观察的分辨率水平上,因此你可能看不到电极尖端形状的改变,而仅仅会看到电极尖端略为回缩变暗。
如果想知道电极尖端是否被熔化而堵塞了,或者想知道尖端的直径,可以用一只小注射器产生空气压力,通过微电极往甲醇中吹气,观察气泡的状况。
经过抛光处理后,玻璃微电极表面变得更加宽阔和光滑。
而在涂敷硅酮树脂时,黏附于电极尖端附近的Sylgard的溶剂也会被抛光加热去除,从而保证封接的顺利进行。
抛光时需注意:在靠近加热线圈的位置以较低的温度抛光电极,其电极尖端内径的玻璃面一般会是平行而且较为尖锐。
而在离加热线圈较远的位置以较高的温度抛光电极,其电极尖端趋向于变圆且变得较钝。
单通道和全细胞记录中应用的电极有所区别,反应在电极的抛光过程中也有所不同,具体如下:
单通道记录时:膜片钳电极应接近加热丝,使接近尖端的玻璃层变厚变尖。
电极入水电阻较高,容易得到较高阻抗的封接。
全细胞记录时:膜片钳电极的玻璃壁应比单通道记录中所用的为细,且尖端较钝为好。
尖端较细的电极形成封接后不容易吸破。
第三节 实验操作
一、 细胞的分离、培养
(一)心肌细胞
1.请问哪位是做豚鼠心肌细胞急性分离的,我想问一下是用什么酶,消化多少分钟得到的心肌细胞状态比较好
[wwggrr]我们做大鼠心肌细胞急性分离。
30ml台氏液(0.06钙)加20mg一型胶原酶,3mg蛋白酶,20mg牛血清白蛋白。
至于消化时间要根据老鼠大小,和灌流速度来定,没有固定的时间。
我们的做法是,在心脏膨大变软后,从心室内吸少量液体在显微镜下找单个心肌细胞,见单个细胞后再延长半分钟到一分钟。
[xuji007]同意楼上的说法,消化时间要自己摸一下。
酶的量也不一定,我记得原来做的时候,20ml液体用了5mg一型胶原酶,3mg蛋白酶。
我个人觉得酶还是要用Sigma的。
[冷月寒星]需要根据你实验室的酶的纯度活性,重新定量,个个实验室是不同的。
我们用的2型胶原酶 8mg,不过是粗酶。
消化时间也受很多因素影响,没毒浓度、温度、豚鼠状态、个人习惯都影响很大,需要即时观察,到豚鼠心肌消化变大变软变色、酶成浑浊,方可剪下。
2.我最近在用离体灌流的方法急性分离大鼠心肌细胞,但是分离到的细胞非常少,而且都是死细胞。
我先是用有钙台氏液灌流5min,再用无钙台氏液灌流5min,然后用消化液灌流(含胶原酶II0.6mg/ml),灌流到流出液变浑浊为止,然后在该消化液中剪碎吹打后离心1分钟(1000转),我消化时间从5min到20min都尝试了,但所得细胞非常少,而且全是团状死的或正在死亡的.请问哪位高人可以给予指点迷津,在下不甚感激,另外以什么标准来衡量心肌消化好了.(我用的是三蒸水,灌流液温度37度)
[冷月寒星]你说分离的细胞非常少,对此,我不是很理解。
如果按以下分析,应该细胞数很多,并且死细胞占大多数。
根据你的实验方法来看,又几点不太合适,建议进行一些调整。
1.“有钙台氏液灌流5min” 时间过长,通常加入有钙液后,只要心肌复跳,
即可停止,改用无钙台式液冲洗。
2. “无钙台氏液灌流5min” 无钙台式液应冲洗至心肌停跳 ,时间长短要
看具体情况而定。
有钙液一定要冲洗干净,否则,加酶后很难分下活细胞。
3.“消化液灌流(含胶原酶II0.6mg/ml)” 0.6的浓度过高,建议在0.2附
近调整,以找到实验室适合的浓度。
4.在我们实验室是不进行离心的,细胞状态不错。
但必须将酶液冲洗干净!
5.剪取心肌的时间,大部分来自于经验,由于,细胞消化时间并不一致,应
该分时间,分不剪取。
总之,各个实验室的条件不同(包括仪器和室温),具体方法只能自己摸索,祝你实验顺利、成功。
[rainwave]试一下以下措施:
1.不要用有钙台氏液灌流5min。
直接用无钙也灌注,时间要足够长,使得细
胞内的钙离子完全排出。
2.取出的心脏可以放在冷的正常1.8钙台氏液中。
3.酶液的时间以心脏的颜色和硬度来确定的。
也可以不断观察流出液体中是
否有心肌细胞,来确定时间。
4.酶灌完后,一定要用台氏液好好冲洗,至少50ml液体。
“该消化液中剪碎
吹打后离心”,坚决不能这样。
5.刚分下来的细胞成活率约为90%以上。
祝你实验成功!
3.请问各位急性分离大鼠心肌细胞的朋友:
我现在遇到的问题是用消化酶灌流4min(0.5mg/ml)心脏后心脏局部就变白,8min左右整个心脏就变白,不知道是什么原因,敬请各位赐教,谢谢
[rainwave]可能原因:
1.冠脉中有微血栓形成,导致灌流不均匀而致。
处死动物之前,先腹腔注射
肝素1000u/kg.
2.大鼠的状态也是非常重要的。
4.我正在做大鼠心肌细胞膜片钳,感觉每次细胞分的都不错,可是在复钙时,细胞就多数收缩死亡,这主要是什么原因,还有在记录电流时,是否必须要灌流,不灌流行吗,另外,细胞似乎很难贴壁,我也试过多聚赖氨酸,效果不是很好,可能是使用不当的原因吗?(是不是,先涂上多聚赖氨酸,等到晾干后再滴细胞悬液
[jixincai]我觉得如果你不用新的培养皿,那你一定要彻底清洗培养皿(首先要泡酸),然后涂上多聚赖氨酸,在室温放置自然晾干,或是用干烤箱烤干(55-65度)然后在滴上细胞悬液,那样细胞贴壁较牢固。
祝好运!
5.你们好!我也是刚开始做心肌细胞不久,分离了有几次细胞,因为没有请landenff什么装置,所以是在体灌流清洗的,之后再取下剪碎酶解的。
用的是0.05的胶原酶,消化半个小时后收集细胞的,不过没有收集酶解液的细胞,而是从新置换外液吹打组织块得来的细胞,刚拿到细胞时也有很多贴壁的细胞,但是杆状的不多,我想问一下多余的那么多的块状,椭球装的细胞是什么细胞,而且我们用杆状细胞进行封接时好象感觉没有细胞膜一样内容物很致密,电极根本抽不动,是什么原因呢?还有细胞好象放置一会就都漂起来了,我想问一下,我拿到的是不是也都是死细胞呢?还有,封接时没有用灌流系统有多大影响呢,是不是不加灌流细胞就会死,根本不能用呢 ?
[为非典郁闷中]你好,你用的是那种动物,对于成年动物来讲,由于其胶原、纤维组织较多,必须灌流,才可以充分消化。
你消化后得到的椭球状的细胞是可能是挛缩后的心肌细胞,如果你没有将血液清洗干净,有可能是红细胞。
你分离出的细胞,在显微镜下如果看到清晰横纹,那是好的细胞。
如果横纹不清,那一定是状态不好的细胞。
无法做实验。
在进行封接之前,一定要用灌流液,灌流5分钟左右,在整个实验过程中也要持续灌流,否则死亡的细胞释放出多种酶,及钙,死细胞的碎片也会影响封接,细胞也会缺乏养分,导致细胞状态不好。
你电极吸不动,可能是你的电极尖端有垃圾(冲灌电极或进入灌流液导致的)。
其实Langendorff装置很简单,用不了很多的钱,需
要一个蠕动泵,一个超级恒温水浴和双层的玻璃管道。
如果想的好的细胞,必须要有一个合适的装置。
[baxiansheng]1.不知你分离的心肌细胞是大鼠的还是豚鼠的,大鼠我们的酶浓度高些,6mg/50ml;豚鼠小些,4mg/50ml。
但我感觉胶原酶P不同批号活性有一些不同。
但实际上实验中酶浓度稍稍偏差一些不太要紧,我称酶的时候常并不精确去称量,大致就行,因为最后酶解停止的程度也是靠自己的感觉。
我感觉豚鼠心肌细胞好分些,消化时间短些,刚分下来的好细胞数量多些。
至于给负压的时候细胞就挛缩,一是可能你选择的细胞本身就不太静止,有时候不仔细看看不出来,盯着看一会就会发现它偶尔会动一下,这种细胞尽管胞膜边缘清晰,横纹清晰,也不能用。
反而是那些看起来并不是非常清晰,而静止的细胞可用。
二是你下电极压得细胞太重了,所以一给负压就动起来。
三是负压给得太大也会这样。
至于下电极压细胞多深,给负压多大,我在丁香园中谈过。
如果你的细胞分得稍稍有些不够,细胞表面有纤维组织,可能会使你下电极压细胞后电阻没有什么反应,导致你压得过深。
或者bath液灌流不太干净,电极尖端入液时碰上脏东西,也会导致电极压细胞后没有反应。
2. 我们做实验时对室温没有特别要求,因为没有这个条件去控制。
至于天
气稍冷些,文献上说对延迟整流钾电流会有影响,引出电流变小。
但对封接的影响我还没碰到过,也没有见过这方面资料。
所以气温因素可能不是主要的。
3. 至于插入主动脉的管不能太粗,直径我还真没测过, 只知道原来的管头
和主动脉管径差不多,甚至还粗一些,挂心脏的时候,要把主动脉撑开,勉强挂上去;现在的管头明显比主动脉管径细,很轻松挂上去,还留有许多空隙。
6.我也是刚开始做心肌细胞钙电流测定不久,但是分离细胞一直都不好,昨天还拿到了些可以的细胞,但是一会就皱缩死亡了,今天和昨天的程序大致上一样,就是酶的浓度由0.05降到0.04,但是时间由8分钟延长到了15分钟,结果细胞全都死亡了,还不如昨天的细胞,请问这是不是由于酶解时间长了的原因。
你一般都是酶解多少时间呢?我们用的是胶原酶2,是灌流消化的。
我还想知道你们是怎么样逐步复钙的,还有细胞最后是保存在钙多大浓度的溶液里的。
我们是保存在KB液里,但是没有逐步复钙。
希望能解答的同仁们给予帮助。
我们用的电极内液的ATP也是冻存前保存的,一个月左右再次更换,不过我觉得有时候能用很长时间。
不知道其他的师兄是怎样的呢 ?
[shel]1) 你在分离细胞的酶液中加入了多少钙,因为钙的量可以影响到细胞的酶解效果和细胞的存活。
2)酶量是一是一个重要的因素,但是你的改动太大了,你的酶量减少了0.01,
但时间却延长了近一倍。
你可以改变酶量,但不要变时间,或者酶量不要变改变时间,可以根据你开始分离出细胞的形态来判断是酶解过头,或酶解不足,如果细胞的量很多,而且碎片多,细胞横纹不清,表明酶解过头,如果细胞量不大,且圆球形的细胞较多,细胞悬液较清,表明酶解不够。
我们做的是豚鼠,同样用胶原酶II ,用量大约14-15mg/40ml,酶解时间大约3分钟左右。