人巨细胞病毒立即早期基因功能的研究进展

第13卷第1期1998 年3 月中国病毒学
V IROL O GIC A SIN IC A
Vol . 13
Mar .
No . 1
1998
人巨细胞病毒立即早期基因功能的研究进展Ξ
李磊徐进平叶林柏
( 武汉大学生命科学学院病毒学系,武汉430072)
R esearch Progress on the Funct i on of Human
Cytomegal ovirus IE G ene
Li L e i Xu J i nping Y e Linbai
( Dep a r t m ent of V i rology , C ol l ege of L if e S c ience , W u h an U n i v ersi t y , W u h an 430072)
关键词人巨细胞病毒, 立即早期基因, 自我调节, 反式激活
K ey w ords HCMV , I E gene , Auto regu latio n , Transactivatio n
人巨细胞病毒( HCMV) 是一种重要的病毒,属于疱疹病毒科,在普通人群中的感染率为80 %以上,对于某些特殊地区和人群,其感染率可高达100 % 。

人群感染HCM V 后,通常呈隐性感染,但对于孕妇和免疫能力低下者(如器官移植病人、艾滋病患者) ,该病毒易导致严重的病症,并且可能与肿瘤的诱发有密切关系1 。

HCM V 基因组为双链DNA ,全长超过240 kbp ,至少包括208 个开放阅读框架(O R F) 。

与疱疹病毒科的其它病毒一样, HCM V 基因的表达呈现出一定的时序性,即表达可分为立即早期( I E) 、早期和晚期。

其中, I E 基因的表达被宿主因子所激活2 ,不需要病毒蛋白质的合成,并在病毒其它基因以及宿主细胞的某些基因的表达和调控方面有着重要的作用。

主要I E 因子( M I E) 是I E 基因中的主要组成部分,由该启动子( M I EP) 转录出的RNA 经过不同方式的拼接,产生长度分别为1 . 95 kb 、2 . 25 kb 和1 . 70 kb 的三种mRNA ,分别编码分子量为72 kDa ( I E172) 、86 kDa ( I E2 86) 、55 kDa ( I E2 55) 的三种蛋白(见图1) 。

三种I E蛋白虽然具有共同的N2末端85 个氨基酸残基,但其功能却相差较远。

以下将对其功能分别进行讨论。

1 I E
2 86 蛋白的功能
I E2 86 蛋白是I E 蛋白中最重要的一种,全长579 个氨基酸。

它具有两种主要功能: ( 1) 对自身启动子( M I E P) 的负调节作用; (2) 对病毒的其它基因、宿主细胞基因、多种异源基因的激活作用。

I E2 86 可与自身启动子上位于TA TA 和转录起始位点之间( - 13～- 1) 的一段DNA 序列
Ξ收稿日期:1997 - 01 - 10 ,修回日期:1997 - 04 - 23
图1 M I E RNA 经不同方式拼接产生三种I E 蛋白
1 ,
2 ,
3 ,
4 ,
5 示外元1 ,2 ,3 ,4 ,5 ,poly A 示加尾处,箭头示转录方向。

相结合,这段DNA 被称为顺式抑制信号( CRS) 3 , 富含A ·T碱基, 序列为5′2C GT T T A GT2
G AA CC23′4 ,该段DNA 序列与细胞中正调节因子作用的DNA序列相重叠2 ,因此I E2 86 能
通过与细胞中的正调节因子竞争作用于两段重迭的DNA序列,来抑制自身蛋白的表达,进行自我调节。

I E2 86 的290～579 氨基酸对这种功能必不可少。

除此以外,没有发现I E2 86 能与其它某段特异性DNA序列相作用。

I E2 86 的另一种重要功能是作为一种反式因子,激活多种启动子,包括病毒UL 4 基因启动子,细胞中的N F2κB P65 启动子,以及异源启动子hsp 70 , H IV 中L T R 等。

195～579 氨基酸为I E2 86 的这种功能所必需。

由于它不能与DNA 直接相互作用,所以I E2 86 的激活功能可能是通过与其它蛋白质的相互作用来实现。

实验表明, I E2 86 能与人胚胎肺成纤维细胞( H EL ) 中16 种分子量为14～200 kDa 的蛋白相结合,这些蛋白都是核蛋白5 ,其中某些蛋白的分子量与已知的某些调控蛋白的分子量相近。

在分别将不同的调控蛋白与I E2 86 直接进行作用后发现, I E286 可与SP1 、Tef21 相结合6 ,但不能与E2 F 、Oct21 相作用7 。

I E2 86 的反式激活作用需要TA TA 元件,但不是通过与它直接接触,而是通过与TA TA2 binding p rotein ( TB P) 的相互作用8 。

体外以及体内实验都已证明I E286 能与TB P 直接相互作用,其作用发生在TB P 的C2末端和I E2 86 的C2末端之间,在消除I E2 86 的N2末端后,它与TB P 的结合能力增强。

I E2 86 的这种与TB P 结合提高转录水平的能力与腺病毒中的E1A 蛋白类似,并可以与E1 A 基因缺失的腺病毒突变株互补9 。

对于某些基因( 如: hsp 70 和原癌基因c2myc ,c2fo s) 的激活, I E2 86 只需要一个极其简单的启动子结构,即位于转录起始位点到其上游约50 bp 的一段DNA ,在这一段DNA 中,除了TA TA 元件外,没有其它的一致序列10 。

但在更多的情况下, I E2 86 的激活作用除需要基本的TA TA 元件外, 还需要一些上游元件( U S E) ,这些上游元件都含有调控蛋白(如SP1 、A TF 等) 的作用序列,从而提示I E2 86 能与这些调控蛋白相作用。

利用不同来源的TA TA 元件和含有不同调控蛋白作用序列的U S E 构建一些启动子,发现I E2 86 对于不同来源的TA TA 元件具有不同的激活能力,表现为hsp 70 > 腺病毒E1 a > SV40 早期启动子, 对于含有不同蛋白作用序列的U S E , 结果也有差异, 表现为C AA T > SP1 = Tef - 1 > A TF6 ,至于不能与I E2 86 相作用的调控蛋白( 如Oct21) , I E2 86 对于含有这些蛋白作用序列的启动子不表现激活能力。

TB P 是转录因子TF ⅡD 的组成部份,除与TB P相结合外, I E2 86 还可与转录因子TF ⅡB
第1 期李磊等:人巨细胞病毒立即早期基因功能的研究进展19
相作用8 。

经分析发现,它与TB P作用的区域( 290～504 氨基酸) 和它与TF ⅡB 作用的区域(290～542 氨基酸) 是重叠的,而这段区域对于I E2 86 的反式激活能力也是必需的,所以I E2 86 激活转录的机制可能在于它在转录因子( TF ⅡB , TF ⅡD 等) 之间以及转录因子与调控蛋白之间充当桥梁作用,将它们联系起来,从而加快或稳定转录起始复合物的形成,提高转录效率。

细胞中存在着大量的负调控蛋白,在需要时,能结合到启动子上游的特定DNA 序列处, 通过阻止正调控蛋白与DNA的结合或其它更直接的机制,来抑制病毒基因或细胞基因的表达。

Dr21 蛋白就是这样的一种负调控蛋白,它能使TB P失活而降低转录水平。

体外以及体内实验都已证明, I E2 86 能与Dr21 相互作用,从而消除后者引起的转录抑制作用11 ,在对病毒UL 4 启动子的研究中也发现, I E2 86 能与细胞中一种负调控蛋白竞争一段重叠的DNA 序列, 从而关闭位于TA TA 和CC AA T 上游的负控制区,并为正调控蛋白(如N F2Y , TF ⅡD) 与DNA 的结合创造条件12 。

所以I E2 86 激活转录的另一种机制可能在于直接与负调控蛋白相互作用,使之失去活性或者与之竞争一段重叠的DNA 序列,以消除其负控制作用,使转录以高效率进行。

实验表明, I E2 86 能在体外形成二聚体5 , 这个功能域位于456～539 氨基酸之间,功能域中存在一个锌指结构和一个螺旋—转角—螺旋结构,但实验证明I E2 86 的这种二聚体化与其功能发挥似乎没有直接联系。

由于这个功能域位于I E2 86 自调节和反式激活都不可缺少的区域内,所以并不能排除二聚体化在发挥功能中的作用。

通常情况下,病毒感染敏感细胞后,病毒的某些基因产物会影响细胞中的生长调节基因和参与细胞周期控制的基因的表达或活性,使细胞建立一种最适于病毒增殖的状态。

I E2 86 可与成视网膜细胞瘤蛋白(p Rb) 相互作用13 。

并可激活多种细胞癌基因( 如c2myc ,c2fo s) 10 和DNA 多聚酶基因、胸苷激酶( T K) 基因14 ,这些基因都可促进DNA 的复制与合成,推动细胞周期的进行。

所以I E2 86 的这种广泛激活功能对于它在宿主细胞中的生存和增殖有着重要意义,同时它对于细胞中负调节蛋白的抑制,也可能是决定病毒在不同细胞中复制数量的重要因素。

2 I E1 72 蛋白的功能
I E1 72 蛋白全长491 个氨基酸, 与I E2 86 不同的是, 它虽然也能作用于自身启动子( M I EP) ,但作用的结果是促进而非抑制自身基因的表达。

另一方面, I E1 72 也具有激活其它基因(包括病毒基因、细胞基因及外源基因) 的能力,其中有些基因是I E1 72 能激活而I E2 86 不能激活的15 ,对有些基因,如二氢叶酸还原酶(D HF R) 等, I E1 72 的激活能力要高于I E2 86 7 ,这种差异可能与I E1 72 所具有的外元4 有关。

但在更多的情况下, I E1 72 的功能却表现为对于I E2 86 反式激活的协同作用,以显著提高I E2 86 对于某些启动子的激活能力16 ,而这些启动子大多都是I E1 72 单独所不能激活的。

然而目前尚未发现I E1 72 能与I E2 86 直接作用5 ,所以I E1 72 的这种协同性可能是通过作用M I EP 以提高I E2 86 的表达水平或是其它更为间接的机制。

虽然I E1 72 是一种核磷蛋白,但不能与DNA直接结合17 ,因此推测I E172 可能也是通过与其它蛋白相互作用来发挥其功能。

I E1 72 不能与TB P 结合, 对启动子的激活也不需要TA TA 元件9 。

但其激活的启动子中一个18 b P的重复序列(5′2C T T AA C GGG A C T T T CC AA2
3′) 与I E1 72 的激活功能有密切联系18 ,通过增加三个串联的18bp 重复序列,可以使原不能被I E1 72 激活的鼠CM V 早期启动子变得可被激活。

这个重复序列类似于调控蛋白N F2κB 的作用序列,因此I E1 72 可能是通过与N F2κB 作用,增强N F2κB 与DNA 的结合能力,从而提高基因的表达水平。

进一步研究表明, H CM V 的感染确实可以增强核中N F2κB 与DNA 的结合能力19。

但I E1 72 不能激活所有含有N F2κB 位点的启动子20 。

此外, I E1 72 也能激活N F2κB 的P65 ( N F2κB 蛋白的一个亚基) 启动子,通过提高N F2κB 的表达水平来增加N F2κB 在细胞周期中的活性21 。

但是, P65 启动子并不含N F2κB 的识别序列,仅含有三个SP1 的识别序列,并且在HCM V 感染细胞中,SP1 的DNA 结合活性的升高与N F2κB 的DNA 结合活性升高是一致的,所以I E1 72 可能也通过与SP1 相互作用来发挥其功能。

研究还表明I E1 72 能与调控蛋白E2 F 相互作用7 ,但并非与DNA 链上而是与游离的E2 F 结合。

E2 F 的DNA 结合活性丧失并不会导致它与I E1 72 结合功能的丧失,并且这种结合只有在加入核抽提液的条件下才能检测得到,经蛋白酶K 处理后的核抽提液失去这种功能,所以,可能存在着某些蛋白因子或其它理化因素对I E1 72 与E2 F 的相互作用起重要影响,与E2 F 结合后, I E172 的激活能力大大提高。

由于在HCM V 感染的细胞中, I E1 72 和I E2 86 的mRNA 都可被检测到,所以在病毒感染过程中, I E1 72 可能主要是作为I E2 86 的协同因子,增强I E2 86 的反式激活能力,但也不排除
I E1 72 单独对某些基因的激活在病毒感染中的作用。

3 I E2 55 蛋白的功能
I E2 55 是I E2 86 的不同拼接产物,与I E2 86 相比缺少365～519 氨基酸,因此自我调节能力丧失,但对于少数启动子I E2 55 也具有激活能力7 。

除此以外, I E2 55 更多地表现出对I E1 72和I E2 86 激活作用的抑制。

因为I E2 55 也可以与TB P 、Tef21 相互作用6 ,所以从结构和效果上分析, I E2 55 这种抑制作用的机制,可能在于同I E2 86 和I E1 72 竞争细胞中的调控蛋白以及转录起始复合物。

在腺病毒科中,也相类似地存在着不同拼接产物之间竞争作用底物的
现象22。

但尚不清楚在病毒感染中, I E2 5 5 是否真正产生, 因为感染过程中, 编码I E2 5 5 的
1 . 7 kb mRNA 虽然存在, 但I E
2 55 只有在加入放线菌酮( C HX) 处理后才能检测出2
3 , 所以
I E55 的作用机制尚只是推测。

除了上述的激活基因表达的功能以外,最近研究表明I E 蛋白还具有抑制细胞程序性死亡(apop to sis) 的功能24 。

I E1 72 和I E2 86 都可以抑制由肿瘤坏死因子- α( TN F2α) 和腺病毒E1 A 蛋白介导的细胞程序性死亡,但对紫外线照射引起的细胞程序性死亡则没有抑制作用。

在对细胞的保护作用中, I E1 比I E2 表现出更高的效率。

虽然它们共有N2末端85 个氨基酸,但该段多肽的缺失不会影响它们的这种功能,提示I E1 72 和I E2 86 可能通过不同机制来保护细胞。

由于I E2 86 可以与P53 基因产物相作用,并阻止其激活转录的能力25 ,所以I E2 86 阻止细胞程序性死亡的机制可能在于与P53 的相互作用。

而关于I E1 72 与P53 蛋白相互作用还未见报道,所以其机制尚不清楚。

细胞程序性死亡是宿主器官抵抗病毒感染、阻止病毒传播和在体内存在的一种重要手段, I E基因是HCM V 感染后最早表达的基因,因此I E 基因的这种功能可能是导致HCM V 在体内形成持续性感染的重要原因,与肿瘤的形成也会有密切联系。

第 1 期 李 磊等 :人巨细胞病毒立即早期基因功能的研究进展 21
综上所述 , H CM V I E 基因产物的功能决定了它在病毒感染的复制中起到重要作用 , I E 蛋 白这种通过蛋白与蛋白之间的相互作用来发挥功能的特点 ,为研究基因表达调控中蛋白质大 分子体系提供了很好的实验模型 。

由于 HCM V 感染率很高 ,并可造成持续性感染 ,因此 ,研究 I E 蛋白的功能和作用机制 ,不仅有利于进一步阐明病毒这种生命形式的本质和病毒与细胞相 互作用的致病机制 ,而且对于 HCM V 感染的临床病理学研究也有重要的指导意义 。

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