CTAB法

CTAB提取液：2％CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)2 g，20 mmoI/L EDTA 0.745 g，100 mmoI ／L Tris-HCI 1.21 g，1.4 mol／L NaCI 8.18 g，加水至100 mL，高压灭菌备用。

CTAB 沉淀液:CTAB 5g／L(0.5g—100ml)，0.04 mol／L(0.234g—100ml) NaCI，加水至100 mL，高压灭菌备用。

DNA抽提：
①取100-200 mg充分磨碎样品于1.5或2.0离心管中。

②加600uLCTAB提取液混匀，于60-65℃水浴中温育1.0-2.0 h。

③加入等体积(600 uL)的Tris的饱和酚:氯仿:异戊醇(25：24：1)振荡器离心管混匀，12 000 r／min离心10 min。

④取上清(水相)于一新离心管中，加等体积的氯仿/异戊醇(24：1)振荡器混匀，12 000 r，min离心10 min。

⑤取上层水相，加入2倍体积的CTAB沉淀液，混匀，室温孵育20—30 min。

室温下12 000 r，min离心，15 min
6、弃上清液，加350uL NaCl溶液(1.2 mol／L DNA溶解液—7.02g---100ml)溶解沉淀，然后加入350 uL氯仿，混匀30S。

⑦12 000 r／min离心10 min，分层，将上清液移至一新的离心管中，加入0.6—0.8体积的异丙醇，混匀，室温静置30 min。

⑥4 ℃，12 000 r／min离心20 min(完全除去上清液)；向沉淀加入500uL，70%乙醇，混匀。

⑨4 ℃，12 000 rlmin离心，5 min，小心仔细倒入上清液，弃之。

⑩a、重复步骤⑨。

室温干燥后，将DNA溶于50～100uL去离子无菌水中，于4℃保存备用。

b、加入100uL TE使DNA完全溶解。

加入RNase A(10 mg／mL)，65℃保温30 min以上。

加入2倍体积预冷的无水乙醇 -20℃静置20 min-30 min，12000 r／min离心10 min。

倒掉上清，加70％的酒精200ul。

洗沉淀，室温干燥，最后DNA溶于30ul ddH20中。

2基因组DNA的提取：
(1)50 mL三角瓶中装7mL一8 rnL土豆液体培养基，从生长2d一3 d的斜面上刮少量孢子接种于该液体培养基中，28℃培养24h-36 h：
(2)取1．5 mL菌液(菌体呈均匀小球状)或是1／4炮弹管体积菌体(菌体呈较大团状)，12000 r／min离心，用dd H20洗2次；
(3)每管加入500uL 5×CTAB(含1％13-巯基乙醇)，液氮中速冷30 S，立即65℃ 30 S，反
(4)加入1／3体积的玻璃珠，漩涡振荡器上高速振荡4 min-5 min。

65℃保温20min，每隔10 min摇匀1次。

(5)加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1，v／v／v)，12000 r／rain离心10 min。

将上清液移入到新的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1，v／v)，12000 r／min离心10 min。

(6)在上清中加入2倍体积预冷的无水乙醇 -20℃静置20 min-30 min，12000 r／min离心10 min。

(7)倒掉上清，加70％的酒精200ul。

洗沉淀，室温干燥。

(8)加入100uL TE使DNA完全溶解。

(9)加入RNase A(10 mg／mL)，65℃保温30 min以上。

(10)重复步骤6—8。

最后DNA溶于30ulddH20中。

原理：CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。

在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

一、CTAB提取缓冲液的经典配方：
Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB
溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。

二、CTAB提取缓冲液的改进配方：
(1) PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖；
(2) 蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离，纯化；
(3)多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。

(29.25g---100ml)用多糖水解酶将多糖降解。

在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。

用PEG8000代替乙醇
沉淀DNA：在500 μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl)，冰浴20min.核酸分离，纯化；
(4) 多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合；
(5) 盐离子的去除：70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸，其它的杂质均被洗掉，达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的
NaAc(pH5.2,3M)，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解。

三、基因组DNA提取常见问题
DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质。

DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应，DNA中残留有金属离子，有RNA的存留。

对策：重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质，重新沉淀DNA，让酒精充分挥发，增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次)，加入RNase降解RNA。

（1）DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。

DNA提取常见问题：材料不新鲜或反复冻融、未很好抑制内源核酸酶的活性、提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断，外源核酸酶污染反复冻融。

尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融，液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液。

在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。

所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。

将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融。

（2）DNA降解，DNA提取常见问题。

实验材料不佳或量少，破壁或裂解不充分，吸附或沉淀不完全，洗涤时DNA丢失。

尽量选用新鲜(幼嫩)的材料，动植物要匀浆研磨充分；G+菌，酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。

高温裂解时，时间适当延长(对于动物细胞,
细菌可增加PK的用量)。

增加吸附的时间、或低温沉淀小心操作。