维甲酸对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织趋化因子表达及炎症反应的影响

维甲酸对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织趋化因子表达及炎症反应
的影响
张莹;李芙蓉;李燕;袁发焕
【摘要】目的探讨不同浓度维甲酸对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾组织趋化因子表达及肾组织炎症反应的影响.方法 135只SD大鼠随机分为假手术组、UUO组和维甲酸治疗组,每组45只.假手术组行左输尿管游离,不结扎;UUO组和维甲酸治疗组行左侧输尿管结扎.维甲酸治疗组术后每天分别给予不同剂量(5,10、20mg/kg)全反式维甲酸(ATRA)皮下注射,假手术组和UUO组注射同体积二甲亚砜花生油溶剂.于术后第3、7、14天观察各组肾小管损害、肾间质炎性细胞浸润程度,免疫组化和RT-PCR法观察病变肾组织趋化因子RANTES、CCR5、MCP-1、MIP-1α和TGF-β1表达情况.结果假手术组大鼠肾组织无明显病理改变,肾组织RANTES、CCR5、MCP-1及MIP-1α无明显表达.随着梗阻时间延长,UUO组大鼠肾间质炎性细胞浸润和肾小管损害逐渐加重(P<0.05),肾组织趋化因子表达进行性增加
(P<0.01).与UUO组相比,维甲酸治疗组肾间质炎性细胞浸润和肾小管损害程度显著减轻(P<0.05),肾组织趋化因子表达显著降低(P<0.01),但不同剂量维甲酸治疗组肾组织趋化因子的表达无明显差异.结论维甲酸能减少UUO大鼠肾间质炎性细胞浸润,减轻肾小管损害,抑制趋化因子表达,从而减轻肾脏炎症反应和纤维化.
【期刊名称】《解放军医学杂志》
【年(卷),期】2010(035)006
【总页数】5页(P651-655)
【关键词】维甲酸;输尿管梗阻;炎症;纤维化
【作者】张莹;李芙蓉;李燕;袁发焕
【作者单位】400037,重庆,第三军医大学新桥医院肾内科,全军肾脏病中心;400037,重庆,第三军医大学新桥医院肾内科,全军肾脏病中心;400037,重庆,第三军医大学新桥医院肾内科,全军肾脏病中心;400037,重庆,第三军医大学新桥医院肾内科,全军肾脏病中心
【正文语种】中文
【中图分类】R693
趋化因子(chemokine)是一类低分子量(8～10kD)诱导分泌型细胞因子,可通过白细胞表面的趋化因子受体控制和调节白细胞的趋化运动及其免疫功能,在机体免疫反应调节中起重要作用。

β亚族趋化因子可激活正常T淋巴细胞表达及分泌调节活化因子(regulated on activation of normal T expressed and secreted,RANTES),后者可通过广泛分布于T淋巴细胞和巨噬细胞表面的特异受体CCR5使炎症细胞趋化于炎症局部并被激活,表达多种炎症因子,参与肾脏慢性炎症反应的发生[1-2]。

单核细胞趋化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、单核细胞炎性因子-1α(monocyte inflammatory protein-1α,MIP-1α)与 RANTES同属β亚族趋化因子,对单核巨噬细胞有强烈的趋化作用,在肾脏固有细胞和浸润的炎症细胞中均可表达[3]。

维甲酸(retinoic acid,RA)是维生素A的活性代谢产物,在机体生长、发育、分化和凋亡过程中起重要调节作用,此外,还具有抗炎症和抗纤维化作用。

本实验拟在前期实验[4]基础上进一步观察不同浓度维甲酸对单侧输尿管梗阻(unilateralureteral obstruction,UUO)大鼠肾脏趋化因子表达的影响,探讨RA对肾脏炎症反应的抑制
作用及其机制,为慢性肾脏疾病肾组织炎症反应和纤维化的防治寻找新的途径。

1 材料与方法
1.1 动物模型建立及分组 135只成年清洁级雄性SD大鼠(第三军医大学实验动物
中心),体重230～250g,随机均分为假手术组(S)、UUO组(U)和维甲酸治疗组(T),每组45只,各组再分为3个亚组,分别称为S1-S3组、U1-U3组、T1-T3 组,每组 15只。

大鼠以2%戊巴比妥钠(3m l/kg)腹腔注射麻醉,维甲酸治疗组行无菌手术剖腹
并结扎左侧输尿管近肾盂端,从手术当天开始,T1、T2、T3组分别每天给予5、10、20mg/kg全反式维甲酸(ATRA,重庆联邦制药有限公司提供,溶于95%花生油和5%二甲亚砜)皮下注射;UUO组同样行无菌手术剖腹并结扎左侧输尿管近肾盂端,从手
术当天开始,每天给予大鼠与维甲酸治疗组同体积的二甲亚砜花生油溶剂皮下注射;
假手术组行无菌手术剖腹,仅分离左侧输尿管但不结扎,从手术当天开始处理同
UUO组。

于术后第3、7、14天每亚组取5只大鼠处死,观察各项指标。

1.2 肾组织病理学检查肾组织石蜡切片行HE染色。

对肾小管损害程度采用百分比评分法进行评估,计算20个高倍视野受损害的肾小管(扩张、萎缩、管型、坏死或
小管炎)数目和相应观察区域肾小管总数,计算受损害肾小管百分比。

1.3 免疫组化检测RANTES蛋白按SP免疫组化试剂盒(北京中杉生物技术公司)说明书进行操作。

石蜡切片,脱蜡至水,加3%H2O2去离子水消除内源性过氧化物酶
活性;置于0.01mol/L枸橼酸缓冲液中微波修复抗原;山羊血清封闭,加1∶100兔抗大鼠 RANTES一抗(武汉博士德公司)工作液,37℃孵育3h;依次加入生物素标记的
羊抗鼠免疫球蛋白和辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液,DAB显色;苏木素复染,干燥后中性树胶封片。

以不加一抗的切片作为阴性对照,已知大鼠肾组织纤维化
阳性染色标本切片为阳性对照。

结果判定:RANTES蛋白阳性表达部位呈棕黄色深染,主要位于肾小管及肾间质。

每例切片随机观察10个不重叠的高倍视野,采用Imag-pro-plus图像分析系统计算RANTES阳性表达部位染色面积与视野内肾小
管肾间质总面积的比值,取平均值作为每只实验大鼠的检测值,进行半定量分析。

1.4 RT-PCR检测目的基因mRNA表达用RNAout抽提剂(纽派公司)提取肾组织总RNA。

按RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)说明书进行RT-PCR反应。

引物由北京赛百盛生物工程公司和上海生物工程公司设计并合成。

RANTES:上游5′-GGG-CAGATGATTCTGAGACAAC-3′,下游5′-CCAGGAATGAGTGGGAGTAGG-3′,产物大小 445bp;CCR5:上游5′-AAGAAAGTCTGGCAATGGTGAGC-3′,下游5′-CTTCCCTGTTAGCAATCAAGCAC-3′,产物大小 227bp;MCP-1:上游5′-CAATGAGTCGGCTGGAGAA-3′,下游5′-GCTTGAGGTGGTTGTGGAA-3′,产物大小280bp;M IP-1α:上游5′-GACTGCCTGCTGCTTCTCC-3′,下游5′-AATGTGCCCTGAGGTCTTTC-3′,产物大小444bp。

GAPDH(用作 RANTES、M IP-1α的内参照):上游5′-TGCTGAGTATGTCGTGGAGT-3′,下游5′-AGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3′, 产物大小289bp;GAPDH(用作CCR5、MCP-1 的内参照)上游5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,下游5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′,产物大小 439bp。

PCR 反应条件
为:94℃4min;94℃变性50s,相应的退火温度(RANTES:55℃;CCR5:54℃;MCP-1:56℃;MIP-1α:57℃;GAPDH:52℃)50s,72℃延伸1min,共36个循环;72℃延伸10min。

产物经1.5%琼脂糖电泳和Chemi-ImagerTM 5500紫外凝胶图像分析系统分析,计算目的基因与内参GAPDH的光密度比值,作为目的基因mRNA表达量。

1.5 统计学处理采用SPSS 11.0统计软件进行分析,计量资料以±s表示,多组间比较采用单因素方差分析。

P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 大鼠术后一般情况全部大鼠切口均一期愈合,无感染。

观察期内各组大鼠未见腹泻、呕吐等症状。

假手术组大鼠食欲、精神、生长发育、毛色、毛形及反应灵敏
度等均正常。

UUO组大鼠术后恢复较好,生长发育正常,精神尚可,体重增长缓慢,毛粗,光泽度稍有下降,活动度亦稍有下降,一般状态比假手术组差。

T1组各时相点大鼠精神、食欲等一般情况与UUO组大鼠相似;T2组大鼠精神可,食欲欠佳,体重稍有下降,毛色发黄,伴有竖毛;T3组大鼠精神、食欲欠佳,体重下降明显,毛色发黄,伴有竖毛、脱毛,4只大鼠并发明显的口角炎、结膜炎,于术后12d死亡1只。

2.2 肾组织形态学改变假手术组大鼠肾脏无明显病理改变。

UUO组术后第3天即可见肾小管扩张,间质单个核炎症细胞浸润,肾间质宽度增加,小管间质轻度病变;第7天肾小管扩张明显,肾间质大量单个核炎症细胞浸润,间质宽度明显增加,偶见萎缩肾小管,小管间质中度病变;第14天可见弥漫的肾小管基底膜增厚皱缩,皮质及外髓较多,肾小管萎缩,纤维化较明显,小管间质重度病变。

维甲酸治疗组大鼠术后各时相点肾组织病变较UUO组同期明显减轻(P＜0.05),各剂量治疗亚组肾组织病变程度之间差异无统计学意义 (P＞0.05,图1、表1)。

图1 U1组及T1组术后第14天肾组织病理改变(HE×400)A.U1组;B.T1组Fig.1 Pathological change in kidney of rats in U1 and T1 group at day 14 post operation(HE×400)
表1 各组大鼠病变肾小管肾间质面积百分比(%,±s,n=5)Tab.1 Percentageof renal tubu lar lesion and interstitial inflammation of respectivegroup of rats(%, ±s,n=5)注:与假手术组相应亚组比较,(1)P＜0.01;与UUO组相应亚组比较,(2)P＜0.05,(3)P＜0.01;与术后3d比较,(4)P＜0.01;与术后7d比较,(5)P＜0.01组别术后时间(d)3 7 14假手术组S1组0.84±0.06 0.89±0.04 0.98±0.09 S2组0.84±0.09 1.01±0.12 1.01±0.10 S3组0.82±0.10 0.91±0.14 1.06±0.15 UUO 组U1组18.39±3.17(1) 31.71±4.25(1)(4) 56.98±4.19(1)(4)(5)U2组
19.28±3.14(1) 30.81±4.55(1)(4) 58.79±5.61(1)(4)(5)U3组19.63±2.37(1) 33.06±4.81(1)(4) 54.34±4.84(1)(4)(5)维甲酸治疗组T1组
10.32±2.28(1)(2)22.07±3.06(1)(2)(4)36.13±5.35(1)(3)(4)(5)T2组
10.82±2.10(1)(2)23.02±2.72(1)(2)(4)34.27±6.75(1)(3)(4)(5)T3组
11.59±2.11(1)(2)20.07±2.77(1)(3)(4)40.17±3.92(1)(3)(4)(5)
2.3 维甲酸对肾组织RANTES蛋白和mRNA表达的影响假手术组肾组织几乎无RANTES蛋白和mRNA表达;UUO组术后第3天可偶见RANTES蛋白微量表达,mRNA无明显阳性表达,随梗阻时间延长,到第7天时RANTES蛋白和mRNA 均呈强阳性表达,第14天时表达最强(P＜0.01);维甲酸治疗组肾组织RANTES蛋白和mRNA表达较UUO组明显减少(P＜0.01),各剂量治疗亚组肾组织RANTES蛋白及mRNA表达之间的差异无统计学意义(P＞0.05,表2,图 2、3)。

表2 各组RANTES阳性面积与小管间质总面积百分比值(%,±s,n=5)Tab.2 Percentage of exp ression area of RANTES protein in respectivegroup of rats(%, ±s,n=5)注:与假手术组相应亚组比较,(1)P＜0.01;与UUO组相应亚组比较,(2)P＜0.05,(3)P＜0.01;与术后3d比较,(4)P＜0.01;与术后7d比较,(5)P＜0.01组别术后时间(d)3 7 14假手术组S1组1.04±0.16 1.20±0.08 1.24±0.23 S2组0.84±0.43 1.19±0.11 1.22±0.18 S3组1.04±0.17 1.25±0.06 1.32±0.22 UUO 组U1组1.23±0.12 6.41±0.29(1)(4) 9.16±0.23(1)(4)(5)U2组1.24±0.14
6.58±0.38(1)(4) 9.65±0.37(1)(4)(5)U3组1.22±0.14 6.19±0.36(1)(4)
9.11±0.24(1)(4)(5)维甲酸治疗组T1组1.03±0.15
3.66±0.27(1)(3)(4)7.13±0.32(1)(3)(4)(5)T2组1.04±0.13
4.05±0.75(1)(3)(4)7.24±0.19(1)(3)(4)(5)T3组1.05±0.14
3.48±0.40(1)(3)(4)7.54±0.49(1)(3)(4)(5)
图2 U1组及 T1组术后第14天肾组织的RANTES蛋白表达(DAB×400)A.U1组;B.T1组Fig.2? Exp r?ession of RANTES protein in kidney in U1 and T?1 group ?at day 14 postoperation(DA B×400)
图3 术后第14天各组大鼠肾组织RANTESmRNA的表达M.Marker;1、3、5 分别为 U1、U2、U3 组,2、4、6 分别为 T1、T2、T3 组,7为 S3组Fig.3 Expression of RANTESm RNA of kidney of respective group at day 14 postoperation
2.4 维甲酸对肾组织CCR5 mRNA表达的影响假手术组肾组织几乎无
CCR5mRNA表达,UUO组术后第3天亦无明显阳性表达,第7天出现阳性表达,且随梗阻时间延长表达增强,到第14天时表达最强(P＜0.01)。

维甲酸治疗组肾组织CCR5 mRNA表达较UUO组明显减少(P＜0.05),各剂量治疗亚组肾组织
CCR5mRNA表达之间的差异无统计学意义(P＞0.05,图4)。

2.5 维甲酸对肾组织MCP-1mRNA表达的影响假手术组肾组织几乎无MCP-
1mRNA表达,UUO术后第3天亦无明显阳性表达,第7天出现明显阳性表达,且随梗阻时间延长表达增强,到第14天时表达最强(P＜0.01)。

维甲酸治疗组肾组织MCP-1 mRNA表达较UUO组明显减少(P＜0.01),各剂量治疗亚组肾组织MCP-1mRNA表达之间的差异无统计学意义(P＞0.05,图 5、6)。

图4 术后第14天各组大鼠肾组织CCR5mRNA表达M.Marker;1、3、5 分别为U1、U2、U3 组,2、4、6 分别为 T1、T2、T3 组,7为 S3组Fig.4 Expression of CCR5mRNA of kidney of respectivegroup of rats at day 14 postoperation 图5 低剂量组各组大鼠肾组织MCP-1mRNA表达M.Marker;1、4、7分别为S1组第 3、7、14 天,2、5、8分别为 U 1组第3、7、14 天,3、6、9 分别为 T1 组第3、7、14 天Fig.5 Expression of MCP-1mRNA of kidney of respective group of ratswith low dosage
图6 术后第14天各组大鼠肾组织MCP-1m RNA表达M.Marker;1、3、5 分别为 U1、U2、U3 组,2、4、6 分别为 T1、T2、T3 组,7为 S3组Fig.6 Exp ression of MCP-1mRNA of kidney of respective group of rats atday 14 post
operation
2.6 维甲酸对肾组织M IP-1αmRNA表达的影响假手术组肾组织几乎无M IP-
1αmRNA表达,UUO组术后第3天亦无明显阳性表达,第7天出现阳性表达,且随梗阻时间延长表达增强,到第14天时表达最强(P＜0.01)。

维甲酸治疗组肾组织M IP-1αmRNA表达较UUO组明显减少(P＜0.05),各剂量治疗亚组肾组织MIP-
1αmRNA表达之间的差异无统计学意义(P＞0.05,图 7、8)。

图7 各低剂量组大鼠肾组织M IP-1αmRNA表达M.marker;1、4、7 分别为S1 组第 3、7、14天,2、5、8分别为 U1组第3、7、14 天,3、6、9 分别为 T1组第3、7、14 天Fig.7 Expression of M IP-1αmRNA of kidney of respectivegroup of rats with low dosage
图8 术后第14天各组大鼠肾组织MIP-1αmRNA表达M.marker;1、3、5 分别为 U1、U2、U3 组,2、4、6 分别为 T1、T2、T3 组,7 为S3 组Fig.8 Expression ofM IP-1αmRNA of kidney of respectivegroup of rats at day 14 postoperation
3 讨论
3.1 维甲酸的疗效维甲酸通过与其特异性受体RAR、RXR结合而参与对多种生长因子、细胞因子等的调控,具有抑制细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化及凋亡等特性,同时还有抗炎症和抗纤维化作用[5-6]。

近来研究发现,RAR、RXR在人类和大鼠的肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞和内皮细胞均广泛表达,因此,维甲酸在肾脏疾病中的作用开始受到关注,但其对肾小管肾间质炎症反应和纤维化的具体作用机制尚不清楚。

本实验观察到,维甲酸能减缓UUO模型大鼠肾间质炎症反应和肾小管的损伤,提示维甲酸具有肾脏保护功能。

给予维甲酸治疗的UUO大鼠,随着趋化因子(RANTES、CCR5、MCP-1、MIP-1α)表达的显著下降,肾组织炎症病变和纤维化程度显著减轻,提示维甲酸可能通过抑制趋化因子的表达而减轻肾组织的炎症反应
和纤维化,这为慢性肾脏疾病的防治提供了新的线索。

3.2 维甲酸的疗效与剂量之间的关系本研究结果表明,不同剂量维甲酸治疗组大鼠梗阻肾组织病理改变及 RANTES、CCR5、MCP-1、MIP-1α的表达水平差异无统计学意义。

Adams等[7]发现13-顺式维甲酸可以显著减轻同种异体肾移植术后大鼠慢性排斥反应而不依赖于给药剂量及给药起始时间,同时单核细胞浸润及增殖活性也明显降低,与本研究结果一致。

这可能与肾组织内维甲酸受体RAR、RXR的表达水平有限,当药物达到一定浓度后再增加剂量疗效也并不增加有关。

本研究给药的起始剂量较文献报道的起始剂量高,因此当给药剂量为5mg/(kg·d)时,其与受体的结合可能已达到饱和。

3.3 维甲酸的毒副作用本研究观察了大鼠术后的一般情况,低剂量维甲酸治疗组各时相点大鼠一般情况与假手术组及UUO组相似;中、高剂量维甲酸治疗组大鼠均表现出不同程度的精神、食欲欠佳,体重下降,毛色发黄、脱毛,口角炎、结膜炎等毒性反应,说明5mg/(kg·d)剂量的维甲酸即具有明显的抑制炎症反应及纤维化的作用,且无明显毒副作用,而10mg/(kg·d)的维甲酸可出现轻微的维甲酸中毒现
象,20mg/(kg·d)的剂量则可出现明显的毒副作用。

因此,在维甲酸抑制炎症反应及纤维化无明显剂量依赖性的情况下,以选择小剂量治疗方案为宜。

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(责任编辑:张小利)。