GenBank数据库中鳜鱼微卫星位点的筛选及特征分析

扩增产物先在 310 %琼脂糖凝胶上检验扩增效果 , 然后在 8 %聚丙烯酰胺凝胶经垂直电泳分离后 , 银 染方法染色检测 。 116 数据统计分析 微卫星标记基因呈共显性 , 直接从表型获知其 基 因 型 。 利 用 Pop Gene 软 件 包 ( http : Π Π ) 统计各微卫星标记的等位基 www1ualberta1caΠ fyehΠ 因的数目 , 根据基因频率分布估计各基因座在群体 中的基因杂合度和多态信息含量 。多态信息含量 ( PIC) 按下列公式 (Botstein et al1 , 1980) 计算 :
1 ,2 1 133
, LIU Hong2Yu , ZHANG
3Hale Waihona Puke 1. Department of Biotechnology and Environment Science , Changsha University , Changsha 410003 , Hunan Province , China 2. College of Animal Science and Technology , Hunan Agricultural University , Changsha 410128 , Hunan Province , China 3. Department of Environmental Science and Engineering , Hunan University , Changsha 410082 , Hunan Province , China Abstract This project made use of bioinformatic mining of microsatellites from genomic resources to identify simple sequence repeats ( SSRs) , or microsatellites. A bioinformatic analysis of 304 nucleotide sequences in Siniperca chuatsi GenBank identified 22 sequences containing 30 microsatellites , account for 9187 % of wholly GenBank database. Cluster analysis indicated that 16 dinucleotide pairs were the most abundant microsatellites , accounting for 53133 % of the total microsatellite2containing sequences ; 11 trinucleotide repeats and 3 tetranucleotide repeats were found in these microsatellite sequences , accounting for 36 166 % and 10101 % respective. 17 primer pairs were designed from these microsatellite sequences. Among the 17 primer pairs , 13 pairs have amplified products , 6 pairs can achieve clear PCR products by Electrophoresis. Genotype analysis results indicated that : the average polymorphism information contents ( PIC) were 01692 ( ranged : 01567 - 01806 ) , were all polymorphic loci [ Acta Zoologica Sinica 53 (1) : 184 - 189 , 2007 ] . Key words Siniperca chuatsi , Microsatellites , GenBank database 关键词 鳜鱼 微卫星 GenBank 数据库
Isolation and characterization of microsatellite loci of Siniperca 3 chuatsi from GenBank database
KUANG Gang2Qiao , LIU Zhen , LU Shuang2Qing 1 2 Jian2She , XIAO Tiao2Yi
trom the National Natural Science Foundation of China (No130571414) , the Natural Science Foundation of Hunan Province (No106JJ20056) , Project from Education Division , Hunan Province (No106C165) ]
动物学报 53 ( 1) :184 - 189 , 2007 Acta Zoologica Sinica
Gen Bank 数据库中鳜鱼微卫星位点的筛选及特
征分析
匡刚桥
1 ,2
3
刘 臻 鲁双庆
1
133
刘红玉 张建社 肖调义
3
1
2
1. 长沙大学生物工程与环境科学系 , 长沙 410003 2. 湖南农业大学动物科技学院 , 长沙 410128 3. 湖南大学环境科学与工程系 , 长沙 410082
微卫星 ( Microsatellite ) 是一类由 2 - 6 个核苷 酸经多次单位串联组成的高度变异重复 DNA 序列 ( Schlotterer and Tautz , 1992) 。它具有按照孟德尔方 式分离 、突变快 、多态信息含量丰富 、呈共显性遗 传等特点 , 其核心序列在同一物种中具有保守性 , 因此 , 可以根据微卫星的侧翼序列设计合适的引物 对其核心序列进行 PCR 扩增 。因此 , 开发适当的 微卫星引物是进行微卫星遗传分析的关键 。目前 , 微卫星标记技术已被广泛应用于大西洋鲑 ( Salmo
mmolΠ L , 引物 014 μ molΠ L , Taq DNA 聚合酶 110 u 。 PCR 反应程序为 : 94 ℃ 预变性 5 min , 94 ℃ 变性 30 s , 退火 45 s , 退火温度依引物而异 , 72 ℃延伸 1 min , 经 35 个循环后 , 72 ℃ 延伸 10 min , 4 ℃ 保存 。
33 通讯作者 (Corresponding author) 1 E2mail : lsq4250440 @yahoo1com1cn Ζ 2007 动物学报 Acta Zoologica Sinica
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2006207231 收稿 , 2006210225 接受
salar) ( Woramet al . , 2003) 、虹鳟 ( Salmo gairdneri )
(Y oung et al . , 1998 ; Sakamoto et al . , 2000 ; Nichols et al . , 2003) 、鲶 ( Silurus spp . ) ( Waldbieser et al . , 2001 ; Liu et al . , 2003 ) 、太平洋牡蛎 ( Crassostrea ( Yu and Guo , 2003 ) 、日本对虾 ( Penaeus ( Li et al . , 2003 ) 、黄 鳝 ( Monopterus japonicus ) ( 鲁 双 庆 等 , 2005a ) 、鲫 鱼 ( Carassius albus )
auratus) gigas)
( 鲁双庆等 , 2005b) 等多种水产动物的遗
传分析 。
3 国家自然科学基金 (30571414) 、湖南省自然科学基金 (06JJ20056) 、湖南省教育厅项目 (06C165) [ This research was funded by the grants

1期
匡刚桥等 : GenBank 数据库中鳜鱼微卫星位点的筛选及特征分析
185
鳜鱼 ( Siniperca ) 是东亚特有的珍贵淡水肉食 性凶猛鱼类 , 隶属鲈形目 ( Perciformes ) 、鳜亚科 ( Sinipercinae) 。我国鳜类资源丰富 , 包括有翘嘴鳜 ( Siniperca chuatsi ) 、大眼鳜 ( Siniperca kneri ) 、暗鳜 ( Siniperca obscura ) 和斑鳜 ( Siniperca scherzeri ) 等多 个种群 。然而 , 不同品种的鳜鱼存在一定的生产性 状差异 , 如翘嘴鳜和大眼鳜生长速度明显大于其它 种类 , 但抗病力较差 ; 斑鳜生长虽慢 , 但抗病力较 强 。这些差异归根结底是遗传上的差异 。因此 , 筛 选多态性微卫星标记 , 分析鳜鱼遗传背景 , 用于分 子辅助选择育种等具有重要的科学意义和应用价 值 。迄今为止 , 尚未见有关鳜鱼微卫星标记研究方 面的报道 , 制约了微卫星标记在鳜鱼遗传学研究中 的应用 。 利用微卫星标记的关键是微卫星位点的分离和 微卫星引物的设计 。因此 , 迫切需要获得大量独立 分离的 、多态信息含量丰富的鳜鱼微卫星标记 。目 前主要有 3 种微卫星标记分离技术 : 1) 1993) , 通过杂交筛选出含有微卫星序列的阳性克 隆 ; 2) 用生物素结合磁珠富集技术先将富含微卫 星的 DNA 片段富集 , 经 PCR 扩 , 1992 ; Huang et al . , 1999 ; Jon et al . , 1993) ; 3 ) 从网上 公开发表的基因组序列数据库资源中筛选微卫星 ( Ramsay et al . , 200繁琐 , 且需要大量的时间和经费。从公共核酸数据 库中筛选微卫星既简便迅速又能节约大量的时间和 经费。因此 , 本研究利用生物信息学方法从公开发 表的鳜鱼 GenBank 数据库中寻找多态信息含量丰富 的微卫星位点 , 为鳜鱼遗传背景分析、遗传图谱构 建及分子标记辅助选择育种等提供候选微卫星标记。
的四碱基序列为查找标准 。单核苷酸重复没有被包 括在内 , 因为其作为多态性标记的实用意义不大 。 113 微卫星引物设计 利用软件 Primer primer510 确定获得的微卫星 序列是否有足够的侧翼序列用以进行引物设计 。选 择的标准参照李华盛等 ( 2005 ) : 7 次以上重复的 双碱基序列 , 5 次以上重复的三碱基序列 , 7 次以 上重复的四碱基序列 。引物长度在 18 - 24 bp 之 间 , 最好是 20 bp ; Tm 值控制在 56 ℃ 左右 ; 尽量避 免二级结构 , 产物长度控制在 100 - 300 bp 之间 。 引物由上海生物工程技术服务有限责任公司合成 。 114 基因组 D NA 的提取 采集湖南沅江流域的翘嘴鳜野生品种 , 共 20 尾 , 抽取尾静脉血液 , ACD 抗凝剂抗凝保存 。采 用修改后的苯酚 - 氯仿法 ( 刘臻等 , 2004) 提取基 因组 DNA 。018 % 琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白仪 ( Eppendorf 产品) 检测 DNA 浓度和纯度 , - 20 ℃ 保 存备用 。 115 PCR 扩增及有用引物检测 PCR 反应体系为 25 μ l , 内含模板 DNA 50 ng , 10 × buffer 215μ l , 25 mmolΠ L MgCl2 215μ l , dNTPs 110