细菌总数与大肠菌群数测定 PPT课件
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初发酵
器材与试 剂
水样、无菌水、三倍乳糖蛋白胨，吸管、酒精灯、 吸球
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大肠菌群数测定
实验步骤： 1.初发酵 （1）2个大试管（内有倒管），100ml水样+已灭 菌的3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（50ml） （2）10支试管（内有倒管），10ml水样+已灭菌 的3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（5ml） （3）培养：37 ℃，24h （4）观察指标： 产酸（黄色），产气（倒管内有气泡）
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第二部分 总大肠菌群数测定
总大肠菌群是指那些能在37ºC，48h之内 发酵乳糖产酸产气的、需氧及兼性厌氧的 革兰氏阴性的无芽胞杆菌。主要包括埃希 氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷 伯氏菌属等菌属的细菌。
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总大肠菌群的检验方法中，多管发酵法适 用于各种水样（包括底泥），但操作复杂 ，需要时间长；滤膜法主要适用于杂质较 少的水样，操作简单快捷
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八、计算
1、菌落计数及报告方法
作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察， 必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下 各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平 均菌落数，供下一步计算时应用。
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在求同稀释度的平均数时，若其中一个平 皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用， 而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释 度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的 一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀， 则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落 数。然后再求该稀释度的平均菌落数。
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2、操作方法
（1）以无菌操作方法用灭菌吸管吸取 1mL充分混匀的水样，注入灭菌平皿中， 倾注约15mL已融化并冷却到45℃左右的 营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水 样与培养基充分混匀。每次检验时应做一 平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养 琼脂培养基作为空白对照
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若大于2则报告其中稀释度较小的菌落总 数。
若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数。
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3）若所有稀释度的平均菌落数均大于300， 则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释 倍数报告之。
4）若所有稀释度的平均菌落数均小于30， 则应以按稀释度最低的平均菌落数乘以稀 释倍数报告之。
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六、仪器设备 1、高压蒸汽灭菌器 2、干热灭菌箱 3﹑培养箱36±1℃ 4、电炉 5、天平 6、冰箱
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7、放大镜或菌落计数器
8、pH计或精密pH试纸
9、灭菌试管、平皿（直径9cm）、刻度 吸管、采样瓶等
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倾注培养
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（2）待冷却凝固后，翻转平皿，使底面 向上，置于36±1℃培养箱内培养24h，进 行菌落计数，即为水样1mL中的细菌总数。
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培养结果
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（3）如果测定水源水
用灭菌吸管取2~3个适宜稀释度的水样 1mL，分别注入灭菌平皿内。以下操作同 生活饮用水的检验步骤。
二、 方法依据：《生活饮用水卫生规范》 （2001）
三、 测定范围 ：水中的细菌总数的测定
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四、 测定原理
细菌总数测定是测定水中需氧菌、兼性厌 氧菌和异样菌密度的方法。因为细菌能以 单独个体、成双成对、链状、成簇等形式 存在，而且没有任何单独一种培养基能满 足一个水样中所有细菌的生理要求。所以 ，由此法所得的菌落可能要低于真正存活 的细菌总数。
主要内容 细菌总数测定 总大肠菌群测定
1
第一部分 细菌总数的测定
测定方法、方法依据以及测定范围 测定原理 检测试剂、仪器设备 分析步骤 结果计算
2
注意事项： 1.无菌操作 2.标记 3.何时更换吸管 4.吸吹混匀 5.琼脂培养基保温 6.安全常识
3
一、 测定方法：平皿计数法
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细菌总数测定
器材一 览
9
七、分析步骤
1、水样的稀释
（1）以无菌操作方法吸取1mL充分混匀 的水样，注入盛有9mL灭菌生理盐水的试 管中，混匀成1:10稀释液。
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（2）吸取1:10的稀释液1mL注入盛有 9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成 1:100稀释液。按同法依次稀释成1:1000， 1:10000稀释液等备用。如此递增稀释一 次，必须更换一支1 mL灭菌吸管。
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5）若所有稀释度的平均菌落数均不在 30~300之间，则应以最接近30或300的 平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
6）若所有稀释度的均无菌落生长，则以 <1乘以稀释倍数报告之。
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7）菌落计数的报告：菌落数在100以内时 按实有数报告，大于100时，采用二位有 效数字，在二位有效数字后面的数值，以 四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的 零数也可用10的指数来表示。
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2、不同稀释度的选择及报告方法
1）首先选择平均菌落数在30~300之间者 进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落 数符合此范围时，则将该菌落数乘以稀释 倍数报告之
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2）若有两个稀释度，其生长的菌落数均 在30~300之间，则视二者之比值来决定， 若其比值小于2应报告两者的平均数。
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五、试剂
营养琼脂
（1）成分，蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯 化钠5g，琼脂10-20g，蒸馏水1000mL
（2）制法，将上述成分混合后，加热溶 解，调整pH值为7.4-7.6，过滤，分装于 玻璃容器中，经121、103.42Pa高压蒸汽 灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
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大肠菌群数测定
注意事项： 1.无菌操作 2.吸管使用 3.洗去染液的方法 4.显微镜保养 5.液体接种
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实验原理 37 ℃，24h，乳糖，产酸（溴甲酚紫），产气
（小倒管） 三步法：初发酵、分离培养、复发酵
器材与试剂 水样、无菌蒸馏水、乳糖蛋白胨培养基，伊红
美蓝培养基，革兰染液 吸管、试管、平皿、载玻片
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初发酵
器材与试 剂
水样、无菌水、三倍乳糖蛋白胨，吸管、酒精灯、 吸球
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大肠菌群数测定
实验步骤： 1.初发酵 （1）2个大试管（内有倒管），100ml水样+已灭 菌的3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（50ml） （2）10支试管（内有倒管），10ml水样+已灭菌 的3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（5ml） （3）培养：37 ℃，24h （4）观察指标： 产酸（黄色），产气（倒管内有气泡）
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第二部分 总大肠菌群数测定
总大肠菌群是指那些能在37ºC，48h之内 发酵乳糖产酸产气的、需氧及兼性厌氧的 革兰氏阴性的无芽胞杆菌。主要包括埃希 氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷 伯氏菌属等菌属的细菌。
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总大肠菌群的检验方法中，多管发酵法适 用于各种水样（包括底泥），但操作复杂 ，需要时间长；滤膜法主要适用于杂质较 少的水样，操作简单快捷
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八、计算
1、菌落计数及报告方法
作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察， 必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下 各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平 均菌落数，供下一步计算时应用。
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在求同稀释度的平均数时，若其中一个平 皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用， 而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释 度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的 一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀， 则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落 数。然后再求该稀释度的平均菌落数。
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2、操作方法
（1）以无菌操作方法用灭菌吸管吸取 1mL充分混匀的水样，注入灭菌平皿中， 倾注约15mL已融化并冷却到45℃左右的 营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水 样与培养基充分混匀。每次检验时应做一 平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养 琼脂培养基作为空白对照
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若大于2则报告其中稀释度较小的菌落总 数。
若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数。
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3）若所有稀释度的平均菌落数均大于300， 则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释 倍数报告之。
4）若所有稀释度的平均菌落数均小于30， 则应以按稀释度最低的平均菌落数乘以稀 释倍数报告之。
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六、仪器设备 1、高压蒸汽灭菌器 2、干热灭菌箱 3﹑培养箱36±1℃ 4、电炉 5、天平 6、冰箱
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7、放大镜或菌落计数器
8、pH计或精密pH试纸
9、灭菌试管、平皿（直径9cm）、刻度 吸管、采样瓶等
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倾注培养
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（2）待冷却凝固后，翻转平皿，使底面 向上，置于36±1℃培养箱内培养24h，进 行菌落计数，即为水样1mL中的细菌总数。
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培养结果
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（3）如果测定水源水
用灭菌吸管取2~3个适宜稀释度的水样 1mL，分别注入灭菌平皿内。以下操作同 生活饮用水的检验步骤。
二、 方法依据：《生活饮用水卫生规范》 （2001）
三、 测定范围 ：水中的细菌总数的测定
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四、 测定原理
细菌总数测定是测定水中需氧菌、兼性厌 氧菌和异样菌密度的方法。因为细菌能以 单独个体、成双成对、链状、成簇等形式 存在，而且没有任何单独一种培养基能满 足一个水样中所有细菌的生理要求。所以 ，由此法所得的菌落可能要低于真正存活 的细菌总数。
主要内容 细菌总数测定 总大肠菌群测定
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第一部分 细菌总数的测定
测定方法、方法依据以及测定范围 测定原理 检测试剂、仪器设备 分析步骤 结果计算
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注意事项： 1.无菌操作 2.标记 3.何时更换吸管 4.吸吹混匀 5.琼脂培养基保温 6.安全常识
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一、 测定方法：平皿计数法
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细菌总数测定
器材一 览
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七、分析步骤
1、水样的稀释
（1）以无菌操作方法吸取1mL充分混匀 的水样，注入盛有9mL灭菌生理盐水的试 管中，混匀成1:10稀释液。
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（2）吸取1:10的稀释液1mL注入盛有 9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成 1:100稀释液。按同法依次稀释成1:1000， 1:10000稀释液等备用。如此递增稀释一 次，必须更换一支1 mL灭菌吸管。
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5）若所有稀释度的平均菌落数均不在 30~300之间，则应以最接近30或300的 平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
6）若所有稀释度的均无菌落生长，则以 <1乘以稀释倍数报告之。
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7）菌落计数的报告：菌落数在100以内时 按实有数报告，大于100时，采用二位有 效数字，在二位有效数字后面的数值，以 四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的 零数也可用10的指数来表示。
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2、不同稀释度的选择及报告方法
1）首先选择平均菌落数在30~300之间者 进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落 数符合此范围时，则将该菌落数乘以稀释 倍数报告之
2019/9/16
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2）若有两个稀释度，其生长的菌落数均 在30~300之间，则视二者之比值来决定， 若其比值小于2应报告两者的平均数。
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五、试剂
营养琼脂
（1）成分，蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯 化钠5g，琼脂10-20g，蒸馏水1000mL
（2）制法，将上述成分混合后，加热溶 解，调整pH值为7.4-7.6，过滤，分装于 玻璃容器中，经121、103.42Pa高压蒸汽 灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
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大肠菌群数测定
注意事项： 1.无菌操作 2.吸管使用 3.洗去染液的方法 4.显微镜保养 5.液体接种
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实验原理 37 ℃，24h，乳糖，产酸（溴甲酚紫），产气
（小倒管） 三步法：初发酵、分离培养、复发酵
器材与试剂 水样、无菌蒸馏水、乳糖蛋白胨培养基，伊红
美蓝培养基，革兰染液 吸管、试管、平皿、载玻片