反相高效液相色谱法测定不同方法炮制关木通中马兜铃酸的含量

反相高效液相色谱法测定不同方法炮制关木通中马兜铃酸的含量目的为了确定中药材关木通的最佳减毒方法，探讨不同炮制方法对中药材
关木通中马兜铃酸的脱除效果。

方法对中药材关木通进行姜炙、醋炙、蜜炙、甘草炙、碱制、炒炙、酒炙以及碱蜜合制、碱酒合制、碱姜合制，采用反相高效液相色谱法测定马兜铃酸的含量，计算马兜铃酸的脱除率。

结果醋炙关木通药材中马兜铃酸的含量为（0.101 000±0.001 700）%，醋炙品水浸出物与醇浸出物的含量相当。

结论醋炙制法为最佳方法。

[Abstract] Objective To explore removal effect of aristolochic acid with different processing methods on Aristolochia Manshuriensis in order to determine the best attenuated method of Aristolochia Manshuriensis. Methods Main ginger，vinegar main，honey main，licorice broiled，alkali system，fried grilled，broiled，alkali and honey also，alkali and liquor also，alkali and ginger also were applied in Aristolochia Manshuriensis. Content of aristolochic acid in Aristolochia Manshuriensis was detected by RP-HPLC，and removal rate of aristolochic acid was calculated. Results Content of aristolochic acid in Aristolochia Manshuriensis with vinegar main was （0.101 000±0.001 700）%，the content of water extract and alcohol extract in vinegar main was quite. Conclusion This vinegar processing is the best way to take effect.
[Key words] RP-HPLC；Processing；Aristolochia Manshuriensis；Aristolochic acid
关木通，别名木通马兜铃、东北木通、马木通、万年藤，为马兜铃科植物。

东北马兜铃Aristolochia manshuriensis Kom.的干燥藤茎可入药，古书记载有通经下乳、利小便、通心火等功效，为临床常用药物。

2000年以來，国内外发生多起由于服用马兜铃属植物的药物引起肾脏毒害事件。

经学者研究证实，引起此类事件的是化合物马兜铃酸。

目前该类药材已被很多国家禁止应用，关木通也已被《中国药典》（2005年版）取消用药标准。

但这种做法并不可取，几乎所有的药物都有损害机体的潜力。

有效成分如在正常范围内则具有治疗作用，但若超出正常范围，就会变成有毒物质。

怎样利用中医特色的炮制方法，将关木通中马兜铃酸的含量降低到0.002%成为问题的关键。

若解决此问题将会为其他含有马兜铃酸中草药的解毒开辟新道路，为临床的安全用药提供科学依据。

本研究用蜜炙、炒炙、姜炙等10种炮制方法处理关木通，采用反相高效液相色谱法对原生药及炮制品中的马兜铃酸进行测定，计算马兜铃酸的脱除率。

关木通中马兜铃酸的限量应不高于《中国药典》（2010年版）细辛中马兜铃酸的限量。

1 仪器与试药
1.1 仪器
采用四元泵、自动进样器和紫外二极管阵列检测器、Agilent 1260高效液相色谱仪、Chemstation工作站来处理数据。

其他仪器：药材粉碎机（广州兴荣机械生产）、TDZ6B-WS型离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）、加压溶剂提取仪（北京吉天仪器有限公司）、洁康PS-D30A型超声仪。

由氮气供压。

1.2 药品
马兜铃酸对照品购自中国食品药品检定研究院，含马兜铃酸A 99.4%；色谱纯甲醇、乙腈、冰醋酸、醋酸乙酯等购自Merck公司；纯水（实验用超纯水机获得）。

1.3 材料
1.3.1 材料来源
关木通购自上海市药材有限公司，经长春中医药大学药学院副院长贡济宇教授鉴定，此品为东北马兜铃的干燥藤茎，为真品。

所涉及的炮制品均由同源生品制得。

姜、蜜、醋、酒为市售产品。

1.3.2 关木通药材的炮制
1.3.
2.1 炒焦制品的制法用分析天平称取关木通药材30 g，置干净的炒锅内，使用文火炒至可以嗅到焦香味即可，倒出，冷却干燥，称重。

将得到的炒焦制品密封保存，待用。

1.3.
2.2 醋炙品制法称取关木通药材30 g，精密量取25 mL陈醋喷洒于药材表面[1]，待药材将醋汁吸收完全后，置炒锅内文火炒至嗅得药材香味即可，倒出，冷却，干燥，称重，即得醋炙品。

密封保存，待用。

1.3.
2.3 酒炙品制法称取关木通药材30 g，量取黄酒20 mL喷洒于药材表面，待药材完全吸收后，文火炒至出现微黄色，倒出，冷却，干燥，称重，即得酒炙品[2]。

密封保存，待用。

1.3.
2.4 蜜炙品制法称取关木通药材30 g，加炼蜜10 g，文火炒至药材将炼蜜全部吸收，倒出，冷却，干燥，称重，即得蜜炙品。

密封保存，待用。

1.
3.2.5 姜炙品制法使用分析天平精密称取关木通药材30 g，将20 mL姜汁均匀喷洒于药材上（生姜榨汁），文火炒至药材将姜汁全部吸收[3]，倒出，冷却，干燥，称重，即得姜炙品。

密封保存，待用。

1.3.
2.6 碱制品制法称取关木通药材30 g，用0.1 mol/L NaHCO3 10倍体积浸泡3次，12 h/次。

浸泡后用水洗至滤液无色，25℃恒温干燥[4]，冷却，称重，
即得碱制品。

密封保存，待用。

1.3.
2.7 甘草炙品制法称取关木通药材30 g，加甘草汁20 mL（取甘草20 g 用8倍量水煎煮，浓缩甘草汁至40 mL），文火炒至药材将甘草汁全部吸收[5]，倒出，冷却，干燥，称重，即得甘草炙品。

密封保存，待用。

1.3.
2.8 碱蜜合制品制法称取关木通药材30 g，用0.1 mol/L NaHCO3 10倍体积浸泡3次，6 h/次。

浸泡后用水洗至滤液无色。

25℃恒温干燥，再加炼蜜10 g[6]，文火炒至药材将炼蜜全部吸收，倒出，冷却，干燥，称重，即得碱蜜制品。

密封保存，待用。

1.3.
2.9 碱姜合制品制法称取关木通药材30 g，用0.1 mol/L NaHCO3 10倍体积浸泡3次，6 h/次。

浸泡后用水洗至滤液无色。

25℃恒温干燥，姜汁20 mL （取新鲜生姜，榨汁机榨汁），文火炒至药材将姜汁全部吸收[7]，倒出，冷却，干燥，称重，即得碱姜制品。

密封保存，待用。

1.3.
2.10 碱酒合制品制法称取关木通药材30 g，用0.1 mol/L NaHCO3 10倍体积浸泡3次，6 h/次。

浸泡后用水洗至滤液无色。

25℃恒温干燥，量取黄酒20 mL喷洒于药材表面[8]，待药材吸收完全后，文火炒至出现微黄色，倒出，冷却，干燥，称重，即得碱酒制品。

密封保存，待用。

2 方法与结果
2.1 反相高效液相色谱法测定马兜铃酸的含量
2.1.1 色谱条件
流动相：甲醇-1%冰醋酸进行梯度洗脱。

1%冰醋酸在15 min内由50%降至5%，检测波长为315 nm，流速为1 mL/min，柱温为30℃[9]。

在此条件下，各组分的分离度较好。

马兜铃酸A的保留时间为13.999 min。

2.1.2 对照样品的制备
精密称取，取马兜铃酸A对照品1 mg，精密称定，加甲醇用定容至50 mL，使用时稀释，制成每毫升含0.2 μg的溶液，即得。

2.1.3 标准曲线制备
分别精密吸取“2.1.2”项下马兜铃酸A对照品溶液5、7、9、12、15 μL[10]，注入液相色谱仪，以进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标。

得到回归方程：y=1.6×105x+21.463，R2=0.9990，马兜铃酸A线性范围为0.0010～0.0030 μg。

2.1.4 关木通不同炮制品中马兜铃酸A的含量测定
将“1.3.2”项中关木通各种炮制品和购买的生品粉末分别过四号筛，分别精密称取1 g，置于25 mL的容量瓶中。

制成溶液，超声，过滤。

在波长315 nm处进行梯度洗脱，流动相是甲醇和1%冰醋酸。

冰醋酸的比例在15 min內由50%降至5%。

将测得的峰面积值代入“2.1.3”项的回归方程中，计算马兜铃酸的浓度值，进而计算其含量。

由表1可知，醋炙和碱制的关木通药材中马兜铃酸的含量较低，并在合格范围内，所以初步确定醋炙和碱制效果较佳。

2.2 浸出物含量测定
2.2.1 供试品溶液的制备
精密称取药材粉末1 g，置于25 mL的容量瓶中，加入甲醇-1%甲酸水溶液约15 mL，两者比例为4∶1。

浸泡1 h后，超声提取3次[11]，15 min/次。

定容至25 mL，过微孔滤膜，收集续滤液，注入1 mL进样瓶中，即得，待用。

2.2.2 水浸出物的测定
使用分析天平精密称取供试品4 g，溶解于250 mL锥形瓶中，加入适量的水（50～100 mL）。

密塞，精密称定重量并记录。

静置冷却至室温后，连接回流装置，并保持微沸1 h。

放冷，将锥形瓶取下，密塞，称量[12]，减失的重量须用蒸馏水补足，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25 mL，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴挥干，于105℃干燥箱中干燥3 h[13]，再于干燥器中冷却30 min，迅速称重，记录数据。

除非另有规定，供试品中水溶性浸出物的百分含量[14]以干燥品来计算。

2.2.3 乙醇浸出物的测定
按“2.2.2”项中水溶性浸出物测定法完成关木通药材中乙醇浸出物的测定。

各个操作项下的溶剂用规定浓度的乙醇替代水。

由表2可知，醋炙品水浸出物与醇浸出物的含量相当，相对于其他方法比较稳定，可认为醋炙为最佳方法。

2.3 方法学考察
2.3.1 精密度的考察
精密量取“2.1.2”项下的对照品溶液，分别平行进样6次，每次的进样量为10 μL[15]并记录峰面积。

峰面积的平均值为1 257 231，计算得RSD = 1.726%（< 2%），符合规定。

结果表明仪器精密度良好，结果准确可信。

2.3.2 重复性的考察
取“1.3.2”项下姜炙关木通粉末，过三号筛[16]，电子分析天平精密称取5份，分别依“2.2.1”项下的供试品溶液制备方法进行制备。

测定含量，记录峰面积，计
算得峰面积的平均值为3 917 288，进而计算出峰面积的RSD = 0.2687%（< 2%），说明仪器重现性良好，结果准确可靠，可以用于含量测定。

2.3.3 稳定性的考察
使用分析天平量取“1.3.2”项下的碱制关木通粉末，过三号筛，精密称取1份，依“2.2.1”项下的方法制成供试溶液。

将供试品放置0、2、4、6、12、24 h后，分别精密量取这6种样品溶液10 μL，分别进样[17]，记录峰面积。

峰面积的平均值为1 646 202，进而计算RSD = 1.12%（< 2%）。

结果表明，供试品在12 h 内稳定性良好，可用于含量测定，结果准确可靠。

2.3.4 回收率的考察
使用分析天平精密量取已知含量的关木通粉末，过三号筛后，精密称取5份，每份各1 g，分别精密添加相应量的对照品，制成溶液，测定含量，记录，结果见表3。

3 讨论
3.1 马兜铃酸的测定方法
由稳定性实验结果显示，供试品溶液放置0 h后测定与放置24 h后测定的相对标准差在误差允许的范围内，说明供试液在24 h内是稳定的，进一步说明此结果具有可信度。

经查阅文献可知，马兜铃属的植物都含有马兜铃酸。

因其具有羧基，所以在流动相中加入冰醋酸，分离度会提高20%，峰形也会得到改善。

从实验结果看，样品的重复性好，稳定性好，可用于马兜铃酸的测定。

本方法简单、准确、快捷，可作为药材关木通中马兜铃酸的含量测定方法。

3.2 炮制方法的合理性
关木通具有坚实的临床基础。

自古以来因其具有毒性，人们常将其与其他药材配伍使用。

本实验严谨地考察了藥材关木通炮制前后马兜铃酸含量的变化。

结果显示，炮制后马兜铃酸的含量比炮制前明显降低，进一步说明通过炮制降低关木通毒性的合理性。

3.3 最佳炮制方法
从炮制品中马兜铃酸含量的测定结果可知，将醋炙法对马兜铃酸的脱除效果进行分析，结果较为理想。

同时，该方法对浸出物的含量几乎没有影响。

综合各实验结果可分析得出，最佳的炮制方法为醋炙。

3.4 本方法的优点
本实验进一步证明，使用反相高效液相色谱法测定马兜铃属药材中马兜铃酸的含量及炮制品中马兜铃酸含量的方法合理、可行，而且具有准确性和灵敏度高的特点。

在分离过程中，选择梯度洗脱的方法，可最大程度地缩短马兜铃酸的分
离周期，提高分离效率。

3.5 本实验的不足
实验过程发现，炮制时的温度及时间也会极大程度地影响炮制后样品中马兜铃酸的含量，还应采用正交试验等多种方法对每种炮制方法的温度、时间进行更深层次的计算与验证，探究其他因素是否对马兜铃酸的含量也有较大影响。

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