课题3 血红蛋白的提取和分离

我国对蛋白质的现阶段研究

我国独立主持国际“人类肝脏蛋白质组 计划”，参加国际人类蛋白质组研究计划中的 “大规模抗体制备”项目

思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？ 选用一定的物理或化学的方法分离具有 不同物理或化学性质的生物大分子。 思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？ 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的 形状和大小、所带电荷的性质和多少、 溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲 和力等等，可以用来分离不同蛋白质。
凝胶色谱法分离蛋白质的原理
㈡ 缓冲溶液：
1、概念：在一定的范围内，能对抗外 来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液 PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具 有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
2、作用： 能够抵制（ 外界的酸或碱 ）的对溶液 的（ PH值 ）的影响，维持PH基本不变。
3、缓冲溶液的配制 通常由（ 1－2 ）种缓冲剂溶解于水 中配制而成。调节缓冲剂的（ 使用比例 ） 就可以制得（ 在不同PH范围内 ）使用的 缓冲液。 思考：说出人体血液中缓冲液。
专题5
DNA和蛋白质技术
课题3 血红蛋白的提取和分离
2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成 这标志着进入了后基因组时代。 人类基因组：指DNA分子所携带的全部 遗传信息。
蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的 总和。主要是对蛋白质功能的研究

新华网首尔１２月２９日电（记者 干玉兰）韩国浦项工 业大学科学家２９日宣布，他们已查明可抑制艾滋病病毒感 染的“ＴＲＩＭ５”蛋白质核心部分的结构。 浦项工业大学生物科学系教授吴秉夏等人，当天公开了 “ＴＲＩＭ５”蛋白质内核心部分“Ｂ３０．２／ＳＰＲＹ” 的三维分子结构，并称已弄清楚这一结构的正确位置及它与 其他结构之间的相互作用。研究成果发表在最新一期《分子 细胞》杂志上。 2００４年英国《自然》杂志曾刊登论文说，“ＴＲＩ Ｍ５”蛋白质可有效抑制艾滋病病毒的感染。此后，世界各 地的很多科学家开始研究“ＴＲＩＭ５”蛋白质的结构，但 到目前为止尚未有人宣称取得突破性进展。
（3）样品加入与洗脱
①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降 到与凝胶面平齐，关闭出口。 ②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加 样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏 凝胶面。 ③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝 胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 ④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当 高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集 流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如 果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） 注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、 使吸管管口沿管壁环绕移动。
分类： 琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。 测定（ 蛋白质相对分子质量 ）通 常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀 酰胺凝胶电泳
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶 中加入( SDS)。SDS能使蛋白质发生完全变性。 由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用 下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是 ( 单条肽链的分子量 )。SDS能与各种蛋白质 形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的 量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而 掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳 迁移率完全取决于( 分子的大小 )。
3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不 同蛋白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异 4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是 A 调节pH B 维持红细胞的能量供应 C 防止微生物生长 D 防止血液凝固
5、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数 或者CO2分子数分别是
分离血红蛋白溶液
有机溶剂
脂类物质
无色透明的甲苯层
白色薄层固体（脂溶性物质沉淀层）
血红蛋白溶液
红色透明液体 暗红色沉淀
红细胞破碎物沉淀 物
（一）样品处理





1、红细胞的洗涤： 目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝 固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆； 用生理盐水洗涤。 2、血红蛋白的释放： 在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放 3、分离血红蛋白溶液： 离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏 斗分出红色透明液体。 4、透析： 装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透 析。
（2）凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。 B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度 及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀 时吸水7.5克。 ②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定 量的凝胶浸泡于蒸馏水中充分溶胀后，配成凝胶悬浮 液。 ③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置 固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装 填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装 均匀。注意装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡 会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
视频（2.14’~）
④洗涤平衡：装填完毕后， 立即用缓冲液洗脱瓶，在 50cm高的操作压下，用 300ml的20mmol/l的磷酸 缓冲液（pH为7.0）充分 洗涤平衡12小时，使凝胶 装填紧密。注意：1、液 面不要低于凝胶表面，否 则可能有气泡混入，影响 液体在柱内的流动与最终 生物大分子物质的分离效 果。2、不能发生洗脱液 流干，露出凝胶颗粒的现 象。
透析过程
视频（3.38’~）
（二）凝胶色谱操作
（1）凝胶色谱柱的制作：
①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作： 打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好， 插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮 塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不 彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位 置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。
视频（2.14’~）
练习巩固
1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋 白质的研究和应用越来越深入，首先要 做的一步是 A 弄清各种蛋白质的空间结构 B 弄清各种蛋白质的功能 C 弄清各种蛋白质的合成过程 D 获得高纯度的蛋白质
2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中， 关于蛋白质的叙述，正确的是 A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于 相对分子质量较大的蛋白质 B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于 相对分子质量较大的蛋白质 C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于 相对分子质量较大的蛋白质 D 二者根本无法比较
电泳检测结果
琼脂糖凝胶电泳
二 实验操作
蛋白质的提取和分离一般分为四步：
样品处理—粗分离—纯化—纯度鉴定
思考 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便 于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞 核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于 提取血红蛋白。
一、基础知识： ㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）：
1、凝胶： 一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的 通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖， 具多孔的凝胶就叫分子筛） 2、概念：根据被分离物质的蛋白质相对 分子质量的大小，利用具有网状结构的凝 胶的分子筛作用，来进行分离。
3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相 对（相对分子质量较小 ）的蛋白质容易进入 凝胶内部的通道，路程（ 较长 ），移动速 相对分子质量较大 度（ 较慢），而（ ）的蛋白 质无法进入凝胶内部的通道，只能在 （凝胶外部）移动，路程（ 较短），移动速 较快），相对分子质量不同的蛋白质因 度（ 此得以分离。 4、具体过程
A 4、2
B 4、4
C 2、1
D、1、1
6、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后 分层顺序自上而下是： 有机溶剂-----脂类物质-----血红蛋白溶液-----红细胞破碎物沉淀
视频（6.30’~）
（三）纯度鉴定

使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电 泳。
二、实验操作




蛋白质的提取和分离一般分为四步： （1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋 白的释放；离心等操作收集血红蛋白溶液。 （2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。 （3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大 的杂质蛋白质除去。 （4）纯度鉴定：通过SDS—聚丙烯酰胺凝 胶电泳鉴定。

3、分离血红蛋白溶液： 4、透析：
红细胞的洗涤
（一）样品处理



1、红细胞的洗涤： 目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝 固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆； 用生理盐水洗涤。 2、血红蛋白的释放： 在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放 3、分离血红蛋白溶液： 离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏 斗分出红色透明液体。 4、透析：
NaH2PO4 H2CO3 /
/
Na2HPO4 NaHCO3
在血红蛋白整个实验室中用的缓冲 液是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模 拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正 常结构和功能，便于观察（红色）和材 料的科学研究（活性） ㈢电泳： 1、概念：指带电粒子在电场作用下发 生迁移的过程。
2、原理：许多重要的生物大分子，如 （多肽、核酸）等都具有( 可解离的基团 ) 在( 一定的PH )下，这些基团会带上 （正电或负电 。在电场的作用下，这些带 ） 电分子会向着与其（ 所带电荷相反的电极 ） 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 （ 带电性质的差异 ）以及分子本身 大小 ）、（ 形状 （ ）的不同使带电分子 产生不同的（ 迁移速度 ），从而实现样 品中各种分子的分离。