饿蚂蝗中黄酮类化合物的抗氧化活性的研究

饿蚂蝗中黄酮类化合物的抗氧化活性的研究
袁见萍;张前军;康文艺;周清娣
【摘要】提取了饿蚂蝗中的黄酮化合物，并研究了其含量及与体外抗氧化活性关系。

用体积分数为75%的乙醇提取饿蚂蝗全草黄酮化合物，并采用HPD-100大孔树脂对粗提液进行精制，利用NaNO2-Al( NO3)3-NaOH显色法和可见分光光度法测定精制黄酮的含量。

采用DPPH和ABTS自由基测定法，对饿蚂蝗黄酮化合物的抗氧化活性进行评价。

结果表明：在自由基清除实验中，精制饿蚂蝗黄酮类化合物自由基清除能力高于未精制的乙醇提取物。

饿蚂蝗黄酮类化合物的体外抗氧化活性与黄酮含量呈正相关性。

%To the flavonoids contents from Desmodium sambuens and relationship with in vitro antioxidant activity were studied. The flavonoids contents which purified by macroporous resins HPD-100 , and the antioxidant activity were assessed through resistance to DPPH and ABTS. The result showed that the purified products were much better than the unpurified products in the quality and ability of anti-oxygenation. There was a positive correlation between the antioxidant capacity and the content of flavonoids in Desmodium sambuens( D C. ).【期刊名称】《广州化工》
【年(卷),期】2014(000)022
【总页数】3页(P79-81)
【关键词】饿蚂蝗;黄酮;抗氧化活性
【作者】袁见萍;张前军;康文艺;周清娣
【作者单位】贵州大学精细化工研究开发中心，贵州贵阳 550025;贵州大学精细
化工研究开发中心，贵州贵阳 550025; 贵州大学化学与化工学院，贵州贵阳550025;河南大学中药研究所，河南开封 475004;澳大利亚悉尼大学化学学院，
澳大利亚悉尼 1797
【正文语种】中文
【中图分类】R284.1;R927.2
饿蚂蝗(Desmodium sambuense)为豆科山蚂蝗植物，具有活血止痛、解毒消肿、清热解毒、消食的功效。

课题组在前期研究发现饿蚂蝗的醇提物及其各部位具有良好保肝活性［3］，建立了饿蚂蝗黄酮和酚含量的测定方法［4－5］。

由于黄酮类化合物是具有良好的活性氧自由基清除作用，因此我们认为饿蚂蝗的抗氧化活性应该与其黄酮含量有关，本文采用HPD－100 大孔树脂对黄酮粗提液进行精制，采
用DPPH 和ABTS 自由基测定法，对饿蚂蝗黄酮化合物的抗氧化活性进行评价，
探讨饿蚂蝗体外抗氧化活性与其黄酮含量的相关性。

1 材料及方法
1.1 材料及仪器
U－1901 型紫外分光光度计，北京谱析通用仪器有限责任公司;TP－114 型电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司;SB－5200D 超声波清洗器(200 W，(40±1)kHz)，宁波新芝生物科技股份有限公司。

槲皮素对照品(批号100081)，中国药品生物制品检定所;DPPH，日本东京化成工
业株式会社;ABTS，Fluka 公司;BHT(二丁基羟基甲苯);PG(propyl gallate，没食子酸丙酯);BHA(butylated hydroxyanisole，丁基羟基茴香醚);乙醇，过硫酸钾及其它试剂均为分析纯;大孔树脂(大孔树脂HPD－100)，河北沧州宝恩化工有限公司。

饿蚂蝗于2012 年采自贵州省贵阳市，经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定为豆科山蚂蝗属 (Desmodium)植物饿蚂蝗Desmodium sambuense D C.的全草。

1.2 方法
1.2.1 饿蚂蝗黄酮化合物的提取及精制
将饿蚂蝗粉碎后，按1∶5 的料液比加入75%乙醇浸泡3 次，每次7 天，合并浸
提液并浓缩得浓缩液，在100 ℃下使用烘箱进行干燥，粉碎得到粗黄酮粉。

粗黄
酮粉用水分散，上HPD－100 大孔树脂，分别用水与20%、40%、60%、80%、100%乙醇洗脱，减压浓缩后，在100 ℃下使用烘箱进行干燥，经研磨得到精制黄酮粉［6］。

1.2.2 黄酮含量的测定［7］
1.2.2.1 对照品溶液的制备
精密称取槲皮素0.021 6 g，60%乙醇溶解，转移至100 mL容量瓶中，60%乙醇定容至刻度，摇匀即得到0.216 mg/mL 的对照品溶液。

1.2.2.2 供试品溶液的制备
称取适量粗黄酮和各洗脱样品，用60%乙醇溶解，定容至25 mL，得供试品溶液。

1.2.2.3 标准曲线的制作
精密吸取槲皮素对照品溶液0.0 mL、2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL、10.0 mL、12.5 mL，分别置于25 mL 容量瓶中，前5 瓶补加60%乙醇至12.5 mL，精密加入
5%NaNO2溶液0.75 mL，摇匀，放置6 min;精密加入10%Al(NO3)3 溶液0.75 mL，摇匀，放置6 min;加入4%NaOH 溶液10 mL，分别用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置15 min。

以不加样品试剂为空白，在510 nm 处分别测吸光度，可得标准曲线。

1.2.2.4 样品黄酮含量的测定
分别取各样品溶液体积适量，于25 mL 容量瓶中，按标准曲线制作方法进行测定，
在510 nm 处分别测其吸光度，由吸光度值和标准曲线计算原理得黄酮含量。

1.2.3 抗氧化活性筛选方法
1.2.3.1 DPPH 方法
按照文献［8］，将样品用甲醇配成一系列浓度，取0.1 mL样品加入3.5 mL DPPH 甲醇溶液(0.06 mmol·L－1)，混合30 min 后于515 nm 处测定吸光度。

每份样品平行测定操作3 次，计算公式为:
式中:Acontrol——3.5 mL DPPH 溶液与0.1 mL 甲醇混合后的吸光度Asample——3.5 mL DPPH 溶液与0.1 mL 样品混合后的吸光度
1.2.3.2 ABTS 方法
按照文献［9］，配制ABTS 自由基工作液。

将样品用甲醇配成一系列浓度，取1 mL 提取物加入1 mL ABTS+·储备液，棕色瓶中混合均匀，30 ℃下保温10 min，在734 nm 处测定吸光度。

每份样品平行测定操作3 次，计算公式为:
式中:Acontrol——1 mL ABTS+·溶液与1 mL 甲醇混合后的吸光度Asample——1 mL ABTS+·溶液与1 mL 样品混合后的吸光度
1.2.3.3 清除率计算
依据上述公式计算得到的清除率，用origin 软件处理，得到样品清除率DPPH 自由基和ABTS 自由基的半数抑制率IC50值。

2 试验结果
2.1 饿蚂蝗黄酮类化合物的提取、精制效果
2.1.1 标准曲线制作
标准曲线考察结果如表1 和图1。

如图1 所示，以对照品浓度为横坐标、吸光度
为纵坐标，得线性回归方程为:Y=5.50528X+0.03239(r=0.9994)。

结果表明槲皮
素在0.021 6 ～0.108 0 mg/mL 呈良好线性关系。

表1 槲皮素标准曲线线性范围考察结果Table 1 The standard curve of quercetin编号取体对积照/m品L(对mg照·品m L浓－1/)测得吸光度1 2.5
0.0216 0.144 2 5.0 0.0432 0.278 3 7.5 0.0648 0.392 4 10.0 0.0864 0.511 5 12.5 0.1080 0.622
图1 槲皮素测定标准曲线Fig.1 Standard curve of quercetin
2.1.2 黄酮含量测定
表2 黄酮含量的测定结果Table 2 The absorbance of the samples of the polyphenols样品称量/mg 体取积出/mL测含得量黄/m酮g Abs 含百量分/%
水43.4 12.5 1.30 0.319 5.99 20% 20.1 5 1.65 0.410 41.04 40% 19.4 4 1.93
0.458 62.02 60% 33.3 2 1.08 0.270 40.35 80% 28.6 10 0.63 0.172 5.46 100% 26.8 12 0.98 0.243 7.58粗提物19 5 0.57 0.159 15.11
由表2 可知，不同浓度乙醇精制的饿蚂蝗黄酮含量差异较大，其中20%、40%、60%乙醇精制的黄酮百分含量分别为41.04%，62.02%，40.35%，而粗提物中含量为15.11%。

通过该实验说明利用HPD－100 大孔树脂精制饿蚂蝗黄酮类化合
物的方法是可行的。

选取20%、40%、60%乙醇精制的黄酮进行抗氧化活性实验。

2.2 抗氧化活性的测定
2.2.1 对DPPH 自由基的清除作用
结果见表3 和图2。

表3 显示，不同浓度乙醇精制的饿蚂蝗黄酮提取液清除DPPH 自由基的能力均弱于阳性对照物对照PG，BHA，BHT 清除DPPH 自由基
的能力(IC50 分别为0.60，3.10 mg·L－1)，其中40%乙醇精制的饿蚂蝗黄酮提取液最强(IC50为16.29 mg·L－1)，约为BHT 清除自由基能力的1/2(IC50为8.08 mg·L－1)。

精制黄酮对DPPH 自由基清除能力的顺序为:40% ＞20%＞60%＞粗
提物。

表3 不同浓度乙醇精制的饿蚂蝗黄酮的抗氧化活性Table 3 The values of IC50 of extracts from different parts of D.C提取物D(m PP g H· LI C－
510)/(AmBgT·S ILC－501)/20% 20.61 5.57 40% 16.29 3.48 60% 21.75 5.90粗提物 23.34 12.99 BHA 3.10 1.65 BHT 8.08 1.97 PG 0.60 1.00
图2 抗氧化剂浓度对DPPH 自由基清除作用Fig.2 The scavenging activity of extracts from D.C to DPPH
2.2.2 对ABTS 自由基的清除作用
图3 饿蚂蝗醇提物浓度对ABTS 自由基的影响Fig.3 The scavenging activity of extracts from D.C to ABTS
表3 显示，不同浓度乙醇精制的饿蚂蝗黄酮清除ABTS 自由基的能力均弱于阳性对照PG，BHA，BHT 清除ABTS 自由基的能力，其中抗氧化活性最好的是40%乙醇精制的饿蚂蝗黄酮提取液(IC50 为3.48 mg·L－1)，与阳性对照BHT，BHA 清除ABTS 自由基的能力(IC50为1.97，1.65 mg·L－1)接近。

其次是20%、60% (IC50分别为5.57，5.90，不同浓度乙醇精制的饿蚂蝗黄酮提取液对ABTS 自由基的清除能力顺序为40%＞20%＞60%＞粗提物。

2.3 讨论
(1)从图2 和图3 可以看出，不同浓度乙醇精制的饿蚂蝗黄酮清除DPPH 和ABTS 自由基的能力随浓度的增大而增大，其随浓度变化最大，自由基清除力趋于平缓;显示不同浓度乙醇精制的饿蚂蝗黄酮清除ABTS 自由基的能力随着浓度的增加而增大;说明不同浓度乙醇精制的饿蚂蝗黄酮清除DPPH 和ABTS 自由基能力与其质量浓度呈正量相关性。

(2)40%乙醇精制的黄酮含量最高，对DPPH 和ABTS 自由基的清除率最大，表明饿蚂蝗抗氧化活性与其黄酮的含量有正相关性，黄酮类成分是饿蚂蝗植物的主要抗氧化物质。

(3)实验结果表明该树脂对饿蚂蝗黄酮成分具有较好的吸附效果，40%部位黄酮含量可达62.02%，比粗黄酮提高了4 倍。

实验结果可为研究饿蚂蝗中黄酮类化合物的提取分离方法提供参考。

3 结论
在自由基清除实验中，精制饿蚂蝗黄酮类化合物自由基清除能力高于未精制的乙醇提取物。

饿蚂蝗黄酮类化合物的体外抗氧化活性与黄酮含量呈正相关性。

参考文献
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