08蛋白质组学

West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University Gao Xiu Feng
二向电泳 ∗SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理: 蛋白质在电泳时，它的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子 的大小和形状等因素。 当在凝胶加入一定量的SDS, 就构成了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统。 SDS使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋 白质-SDS复合物，使蛋白质在水中的形状呈椭圆形，只是大小不同; 由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质的SDS复合物都带有几乎 相同密度的负电荷，大大超过了蛋白质分子原有所带的负电荷，因而掩盖 了不同蛋白质电荷之间的差别。这样蛋白质-SDS复合物在聚丙烯酰胺凝胶 电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而是取决于蛋白 质分子量的大小。 质分子量的大小 能分辨100个点. 能分辨100个点
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蛋白质组学研究内容
蛋白质动态表达谱 蛋白质相互作用 蛋白质的结构 蛋白质细胞定位 同功蛋白 蛋白修饰
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主要内容
• 定义 • 蛋白质组学研究内容 • 历史背景 • 主要技术路线 • 三大基本支撑技术 • 目前存在的问题
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定义: 蛋白质组是指一个基因组、一种 生物、一种细胞或组织所表达的全套 蛋白质。 蛋白质组学是在整体水平上研究 细胞内蛋白质组成及其活动规律的科 学.
历史背景
• 1994年,在意大利Siena召开的2-DE会议上, 澳大 利亚Macquarie大学的Marc Wilkins首次提出 Proteome一词. • 同年他的导师Keith Williams向政府提议要对某 种生物的所有蛋白质全部进行质谱筛选和序列 分析. • 1995年 悉尼大学H 1995年, 悉尼大学Humphery S ith I实验室与 h Smith Williams等4家实验室合作,对目前已知最小的自 我复制的生物Mycoplasma genitalium(一种支原体) y p g ( ) 进行了蛋白质成分的大规模分离与鉴定, 并在文 献中首次公开使用了Proteome一词.
样品处理的基本原则
• 尽可能采用简单的方法进行处理,以免蛋 白丢失. 白丢失 • 细胞和组织样品的制备尽可能减少蛋白的 降解,低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白 降解 低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白 的降解. • 样品裂解液应该新鲜制备 已制备好的样 样品裂解液应该新鲜制备,已制备好的样 品不要反复冻溶,保存在-80℃. • 加入尿素之后加温要小于37℃ 因为加热 加入尿素之后加温要小于37℃, 后尿素分解产生的异氰酸盐可对蛋白质产 , 生氨基甲酰化修饰,引起电荷改变.
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一向电泳 ∗等电聚焦电泳
蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离 ，氨 酸残 链中 ，在 定 外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的 pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基 。 团。 *蛋白质的等电点(isoelectric point,pI) p ， 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离 成正、负离子的趋势相等，净电荷为零，此时 p 。 溶液的pH称为蛋白质的等电点。
固相pH梯度. 最多能分辨100个点.
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IPG胶条的使用方法
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主要研究方向
• 针对有基因组或转录组数据库的生物体 或组织/细胞,建立蛋白质组或亚蛋白质组 (或蛋白质表达谱)及其蛋白质连锁群研究. • 以重要生命过程或人类重大疾病为对象, 进行重要生理/病理体系或过程的比较蛋白 质组学研究. • 蛋白质组学支撑技术平台和生物信息学 的研究.
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国内外研究现状
中国人类肝脏蛋白质组计划：申请国内专利数61项， 获得国内专利13项，发表论文160篇，其中在国际杂志 上刊登文章126篇。
West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University Gao Xiu • 单细胞真核生物蛋白质组的研究现状 • 多细胞生物蛋白质组研究现状 • 哺乳动物蛋白质组学的研究现状
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• 1997年,发展到美国、丹麦、瑞士、英国、法国、 日本、瑞典、意大利、德国等10个国家,同年我 国国家自然科学基金委设立了 “蛋白质组学技 术研究”的重大项目 • 2001 2 15 16日 国际人类基因组计划与美国 2001.2.15-16日 Celera公司分别在Nature和Science上公布了人类 基因组草图.同一版面上发布了人类蛋白质组学 基因组草图 同一版面上发布了人类蛋白质组学 组织(Human proteome organization, HUPO)成立 的消息. 的消息 • 2006.1.18 中国人类肝脏蛋白质组计划启动.
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固相pH梯度
(immobilized pH gradient, IPG)
IPG胶条:基本物质是有丙烯酰胺结构的8种 衍生物, 构成了pH3-10不同值的缓冲体系, 胶的聚合是在固相的载体上进行, 所以称为
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组织样品
正常组织或肿瘤组织．
不同细胞的分离方法: 免疫亲和技术 微量切割技术
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可溶性样品
血清、血浆、尿样、脑脊液、组织液 以及细胞和组织的水溶性提取物． 以及细胞和组织的水溶性提取物 • 蛋白浓度较高的样品(血清、血浆)可稀释 ( ) 后直接分析； ( ) • 高丰度蛋白质(白蛋白或免疫球蛋白)在电 泳时会干扰表达量少的蛋白质，应除去后进 行电泳。 • 低浓度蛋白或高盐样品，可透析或液相色 谱脱盐等方法。
细胞样品 胞样品
体外培养的细胞，组织细胞等．
悬浮培养生长的细胞： 理想的方法是通过离心收集，随后用磷酸缓 冲液清洗并保存在缓冲液中。 固体培养基中培养的细胞： 首先要除去培养基质，用磷酸缓冲液或等渗 蔗糖清洗细胞层，可有效的减少干扰一向等电聚 焦电泳的盐离子。通过刮擦的方法收集细胞，避 免使用蛋白裂解酶. 免使用蛋白裂解酶 如果细胞核酸过高，粘度较大，可用不含蛋 白质酶的DNase / RNase混合物来处理样品. 质酶 ase ase 处理
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三大基本支撑技术
• 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术
( (two dimensional p y y polyacrylamide g gel electrophoresis, 2-DE)
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等电聚焦电泳的原理
在聚丙烯酰胺凝胶中加入两性电解质载 体,使其在电场中形成一个连续且稳定的线 性或非线性的pH梯度,使pH从凝胶的正极向 负极依次递增,电泳时被分离的蛋白质在偏 离等电点的pH位置时，因带有电荷而移动, 到达等电点区域时便不再移动.因此可根据 等电点的不同使蛋白质得到彼此分离.
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主要技术路线
☞ 样品选择和处理 ☞ 蛋白质分离 ☞ 蛋白质的识别和鉴定
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启动实施一年的我国生命科学领域最大的自主创 新项目——“中国人类肝脏蛋白质组计划”研究取 得重要成果，规模化分离和鉴定人类肝脏表达蛋 白质60余万个，构建了国际上第一个系统的人类 器官蛋白质组“蓝图”。系统揭示了人类肝脏表 “ ” 系 达的基因组，发现由1000余个蛋白质—蛋白质参 与的蛋白质网络图，建立了2000余株抗肝脏表达 与的蛋白质网络图 建立了2000余株抗肝脏表达 蛋白的单克隆抗体，大规模表达了数以千计的蛋 白质。 。
蛋白质组学 proteomics 高秀峰
XiuXiu-feng Gao
四川大学华西基础医学与法医学院 West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University Si h U i it
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• 计算机图象分析和大规模数据处 理技术 • 生物质谱技术
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2-DE又称双向电泳 2 DE又称双向电泳
原理: 是根据蛋白质的两个一级属性： 等电点和分子量的特异性，将蛋白质 等电点和分子量的特异性 将蛋白质 混合物在电荷和分子量两个水平上进 行分离。 行分离 一向：等电聚焦电泳 二向：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳