第九讲凝胶电泳技术ppt幻灯片

3、 DNA分子的构象 当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离
不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量 的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度 是不一样的,超螺旋DNA移动快,而线状双链DNA移动要 慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA 带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其 他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用 同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出 现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。
4、 电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电
压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量 的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大, 因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压 增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大 于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得 超过5v/cm。
电泳槽
梳子
制胶板
负极电 源插孔
正极电
源插孔 电泳槽
电泳仪 电泳槽
电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型 ①分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子 迁移率要快； ②同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比 线性DNA分子要快，线性DNA分子比开环DNA分子 要快。
图2 线性DNA电泳图
第一节 凝胶电泳技术
凝胶电泳（Gel electrophoresis） 是以凝胶为载体，以电流为驱动，用于分离不同大小、
形状、等电点等分子的技术。凝胶电泳通常用于分析用途。 但也可以作为制备技术，如在使用质谱(MS)、PCR、克隆、 DNA测序、免疫印迹等检测之前用于提纯分子。
一、核酸的凝胶电泳
Separation Range Vs. % Agarose
Low Geling Agarose 4-6
0.02-0.4
注意：EB（Ethidium bromide，溴化乙锭）为强致癌物！！！
Agarose gel electrophoresis
凝胶成像仪
用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算
二、琼脂糖凝胶电泳的的影响因素
琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基 质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH 值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列 多种因素决定:
1、 DNA的分子大小: 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的 迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所 受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移 得越慢。
电泳反冲液
• TAE:电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分 离效果。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜） 不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。
•TBE:缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电 泳小于1kb的片段时分离效果更好（常用）。 •TPE的缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中 析出，所以也不宜在回收DNA片段的电泳中使用。
2、 琼脂糖浓度 一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同
浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对 数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于 DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓 度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为 0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为 0.8-1.0%。
5、嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,
染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的 环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低 15％。
6、 离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳
迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶), 电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲 液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热, 严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
第九讲凝胶Байду номын сангаас泳技 术ppt幻灯片
• 凝胶电泳(gel electrophoresis)技术
• 核酸分子杂交技术
• 蛋白分子杂交技术
• 细胞转化（原核）/转染（真核）
• PCR扩增
• DNA测序
DNA干扰(RNAi):转录后基因沉默技术
• 基本原理
在buffer为PH8.0时，带有负电荷的 DNA或RNA核苷 酸链，依靠无反应活性的稳定介质（琼脂糖凝胶或聚丙烯 酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移 向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以 及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成 分彼此分开。
电源线
• LMP琼脂糖 熔点：62～65℃ 熔解后，在37℃ 可保持液态数小时； 在25℃ 可保持液态约10min 应用：直接酶切，回收DNA分子； 在65℃ 下将LMP琼脂糖凝胶熔化； 加入过量的酚抽提DNA； 离心获得含DNA分子的上清液。
琼脂糖凝胶电泳图
• 琼脂糖凝胶电泳的参数：
缓冲液：1× TAE或TBE 凝胶的含量：根据检测的DNA大小 加DNA样品：<1μg，指示剂 电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间 染色和观察：溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色， 在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）。能看到0.05 μg的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比
凝胶电泳的分辨力： 与凝胶的类型和密度相关
琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间; 聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之间
琼脂糖凝胶电泳图
聚丙烯酰胺凝胶电泳图（高 分辨率，1bp差异可区分）
（一）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的
线性多糖聚合物。
分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP） 琼脂糖。
第二节 分子杂交
一 Southern杂交 二 Northern杂交 三 菌落原位杂交 四 Western杂交
分子杂交
(molecule hybridization)
• 【分子杂交】是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析 方法，用已知标记的核酸分子或蛋白质分子检测混合样品 中未知核酸分子或蛋白质分子，以及其相对分子量大小。