基于DH-PSF与DG结合三维荧光动态成像重构方法研究及处理结果

第37卷第1期2018年2月电子显微学报Journal o! Chinese Electron M icroscopy SocietyVol. 37,N〇. 12018-02文章编号：1000-6281(2018)01~0064~07基于DH-PSF与DG结合三维荧光动态成像重构方法研究及处理结果李恒u，陈丹妮1S,屈军乐\郭宝平1(1.深圳大学光电工程学院，光电子器件与系统（教育部/广东省）重点实验室，广东深圳518060;2.深圳大学信息工程学院，广东深圳518060)摘要针对超分辨成像方法景深不够的局限性，发展了具有超大景深的三维超分辨成像系统，通过点扩展函数的改造，形成携带有三维信息的双螺旋点形式，同时结合变形光栅能够在12p m轴向范围内实现荧光分子的实 时位置信息获取，为了精确地获得荧光分子的定位，利用模式识别方法实现图像重构，通过系统标定获取匹配图 像，利用相关性计算以及拟合算法获取分子的三维位置信息。

实验验证，该方法可以高效实现图像信息获取，为D H-P S F与D G结合方法实现三维成像奠定了基础。

关键词三维成像；双螺旋点扩展函数；变形光栅；模式识别；动态追踪中图分类号：Q63;0437文献标识码：A doi：10. 3969/j. issn. 1000-6281. 2018. 01. 010细胞参与生命活动的基础是细胞内外大量的生 物大分子之间的相互作用，对科学家们而言,生命过 程中对分子机制的理解和交互过程的观察分析是非 常必要的[1]。

在分子水平上揭示细胞的生物化学 过程不仅能够深入了解生命活动的本质，同时对于 疾病的诊断、治疗以及药理研究等都具有潜在的应 用价值[2]。

电子显微镜是最早能够实现细胞内的纳米级微 结构的超分辨观察，当时其受限于不能进行在体研 究，使得对细胞的内环境和相互作用关系无法实现,光学显微方法的快速发展已经将对细胞的研究不再 限制于细胞离体提纯以及固定细胞等方式进行，目前的多种成像方法已经可以实现厚样品成像以及活 细胞成像。

但由于受到光学衍射极限的限制，传统 光学显微成像的分辨率分别是横向200 n m和轴向 500 nm,因此突破衍射极限分辨率成为了光学显微 成像技术发展的必然趋势[3-4]。

随着STED、ST0R M、PALM S IM等超分辨成像 方法的出现[5_9]，突破衍射极限的方法已经广泛利 用。

同时引入大量的用于提高轴向分辨率的方法, 结合单分子定位等方式，以获得三维方向的纳米分 *辨。

目前采用较多的方法有:柱面镜像散成像、双焦 面探测、荧光干涉法、双螺旋点扩展函数法等[10-|4]。

本文利用双螺旋点扩展函数（DH-PSF)三维成 像特点与变形光栅（D G)扩展景深的优势相结合来 实现大景深三维纳米分辨成像[15-23],以此得到完整 细胞的三维成像。

由于系统是基于D H-PSF方法，成像方面具有双螺旋形式的特殊性,常见的单分子 定位方法诸如质心定位、高斯拟合等方式不完全适 应，需要根据D H-P S F的特性并结合D G的扩展景 深特性得到相应的定位算法[24]。

本文将对所搭建 的成像系统的图像重构以及精度定位进行介绍，并 最终得到相应的活细胞内的多分子追踪成像结果。

1基于D H-P S F与D G结合三维成像方法的概要D H-PSF方法是基于传统的宽场荧光显微成像 上进行的改造,是利用点扩展函数改造形成具有连 续旋转的双螺旋形式,旋转方向与荧光分子的轴向 位置相关，从而获得荧光分子的轴向定位。

DH-PSF 相比其他轴向方法具有更长的可探测焦深范围，在 整个成像深度内，由于D H-PSF具有的自成像特性,收稿日期:2017 -07 -13;修订日期:2017 -08 -24基金项目：国家重点基础研究发展计划（973计划）（No. 2012CB825802);国家自然科学基金资助项目（Nos. 61605127,11004136,61235012, 61178080);广东省自然科学基金资助项目（No. 2014A030312008);深圳市科技计划资助项目（Nos. GJHS20120621155433884, JCYJ20120613173049560,JCYJ20150324141711698).作者简介：李f旦（1985 -),男（汉族），陕西三原人，助理研究员■ E-mail:liheng@. cn*通讯作者：陈丹妮（1976 -),女（汉族），湖南长沙人，副研究员.E-mail:dannyc007@第1期李恒等:基于DH-PSF与DG结合三维荧光动态成像重构方法研究及处理结果65螺旋点形态近似不变，仅随轴向位置发生旋转，易于 实现轴向定位，通过设计能够实现4 p m范围内的 三维成像。

而结合变形光栅能够进一步扩展成像景深，变 形光栅是一个离轴的菲涅尔波带片，同时具有光栅 分光和聚焦的能力，能够并行成像不同深度的样品 信息。

所形成的三个衍射级次设定为4 p m的轴向 深度，总的深度可以达到12 p m，并行成像的空间位 置由衍射光栅栅距以及探测器接收面相匹配。

利用变形光栅可将厚度12 p m的样品分割为3 段，每一个小的片段处于弥散斑扩散范围以内，通过 双螺旋点扩展函数将每一个片段相位调制改造为具 有连续旋转的双螺旋点，由此可实现片段的三维定 位，并最终得到厚样品的三维信息，因此将DH-PSF 与D G进行相位叠加，以形成同时具有两种性能的 相位函数，并以此得到相应的相位片。

前期已建立基于D H-PSF与D G结合的三维成 像系统[25]，如图1所示，以X81奥林巴斯倒置荧光 显微为基础，物镜放大倍率为100 x，数值孔径1.4, 探测器采用电子倍增CCD(EM CCD，iXon 885)。

样 品放置在显微镜样品台上，激光经扩束准直（beam expansion，B E)后通过管镜（TL1)聚焦到物镜前焦 面，由物镜产生平行光形成宽场照明从而激发样品 产生荧光，所产生荧光经物镜收集由双色镜（DM)分光通过管镜(TL2 )聚焦到成像面（虚线），为了对 所产生的荧光进行相位调制延长光路因此引入一组 4F系统（L1和L2)，相位片（PM)置于4F系统的傅 里叶面，调制后的荧光信号最终成像到探测器(EM CCD)上，采集的数据实时保存。

BE EX图1基于D H-P S F与D G结合的三维动态成像系统。

Fig. 1 Three dimensional d y n a m i c imagingsystem based on D H-P S F a n d D G.2模型建立及图像重构双螺旋点扩展函数是利用形成的双螺旋点所形成的角度和所在位置信息而得到三维定位的，因此 常见的定位方法较难实现，考虑到双螺旋点连续旋 转的特殊性质，采用模式识别的方式进行重构更加 适合。

模式识别是利用图像与匹配图进行数据匹配 处理，反应该图像与匹配图像的相关性，通过相关性 计算可以获知原始数据上有效数据的粗略位置信息 和相关性强度，得到有效处理区域，通过原始图像中 对有效区域范围内图像进行拟合处理得到最终定位 结果，具体的流程如图2所示，整个的数据过程关键 在于匹配图像的获取以及相关性计算。

图2三维重构流程图。

Fig. 2F l o w diagram of 3D reconstruction.匹配图像定义为t(x，y)，由单幅图像考虑，对 原始图像众x，y)进行处理，与匹配图像得到在给定 的位置(P，^ )处两者的区域相关运算：r(p，q) = ^(p，q)(-p，- q)，*表示二者卷积^即为两幅图像的相关结果，表示 区域相关的极大值信息。

上述是通过空间域的卷积获取，而在空间域上，由于振幅的大小会造成误差增大，以及由卷积所造 成的计算量增加，因此在傅里叶域下进行计算，将极 大提高计算速度，同时在傅里叶域情况下，输入图像 与匹配图像的振幅归一化，避免了振幅造成的匹配 误差，傅里叶域情况下的计算公式：r(x，y)二FT~FTs FTt*FTs FTt}，F T表示二维傅里叶变化，F T-1表示二维逆傅里叶 变化，由上述相关图像来得到相关性结果，由此获知 与匹配图像的相关性大小以及空间位置信息，以此 信息作为D H-P S F的基本信息，由此对图像的各双 螺旋点进行提取和计算从而得到三维信息存储，因此匹配图像是作为重构的重要条件。

匹配图像的获取实质上也是对系统的标定，利 用 100 nm 荧光微球（Trans Fluo Spheresd，Thermo66电子显微学报 J. Chin. Electr. Microsc. Soc.第37卷图3匹配图像拟合情况。

a.双螺旋点扩展数点拟合结果;b. Z 轴移动量与旋转角度的对应关系。

Fig. 3Fitting results of m a t c h e d images. a. Fitting results of double helix point P S F ；b. Corresponding relationship betweenZ axis displacement a n d rotation angle.图4是利用双高斯拟合的方式得到整个轴向范 围内不同级次匹配图像的处理结果，黄色部分是相 邻级次位置处所形成的双螺旋点的重叠部分，根据 各级次的角度位置取临界值，由此-1级旋转角度为-85。

〜90。

，而对应0级的旋转角度为-85。

〜 84。

，对应1级的旋转角度为-90。

〜80。

三个级次 上各自匹配图像的模板，如图所示。

同时获得在不 同级次中各轴向位置处(％，y ，z )所对应的定位精度， 在30 m s 曝光时间下，荧光微球移动到0级和± 1级 空间旋转角度为0。

时总光子数分别为4 100和 3 500,由于变形光栅栅极衍射效应影响，0级位置的精度略高于± 1级，计算得到所对应级次的平均定位精度为 ^ -1st (%，y ，z ) =(7 nm ，10 nm ，24nm )，^0th (x ，y ，z ) = (4 nm ，3 nm ，11 nm )，^ + 1st(x ，y ，z ) = (6 nm ，7 nm ，19 nm )。

匹配图像的获取是模式识别中重要的一步，通 过与所需要计算的图像进行相关性计算，识别出图 像所对应的有效信息区域并进行提取，初步确定整 个图片中符合匹配图像的点，并进行标识，最终通过 对所表示的图像区域的点进行双高斯拟合得到拟合 数据，从而整合数据获得三维成像结果。

Fisher 公司，激发谱/发射谱:488/550 nm )作为基准标记物，结合纳米位移台与成像系统进行同步探测， 获取荧光微球成像所得相应匹配图像角度与位置信息的对应关系。