抗幽门螺杆菌UreB蛋白免疫乳的制备

抗幽门螺杆菌UreB蛋白免疫乳的制备
章玉涛;王加启;赵圣国;孙鹏;卜登攀;周凌云;李发弟
【摘要】诱导UreB蛋白克隆菌株表达UreB蛋白,并制备成亚单位疫苗,免疫正常泌乳奶牛,测定乳清中特异性抗体效价以及牛乳常规成分、血清常规成分等健康指标.结果表明:UreB蛋白表达浓度为0.39 mg/mL;乳清特异性抗体IgG和IgM效价显著高于对照组(P＜0.05),IgA效价有所上升,但未达到显著水平(P＞0.05)；奶牛血清中各项生理生化指标没有显著变化(P＞0.05),乳清中除非脂型固形物差异显著外(P＜0.05),其余指标没有显著差异(P＞0.05).说明幽门螺杆菌UreB亚单位疫苗可以有效提高牛奶中特异性抗体的浓度,并对奶牛健康及牛奶成分没有显著影响.
【期刊名称】《甘肃农业大学学报》
【年(卷),期】2011(046)004
【总页数】6页(P1-6)
【关键词】奶牛;幽门螺杆菌;尿素酶B;免疫乳
【作者】章玉涛;王加启;赵圣国;孙鹏;卜登攀;周凌云;李发弟
【作者单位】甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃兰州730070;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,动物营养学国家重点实验室,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,动物营养学国家重点实验室,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,动物营养学国家重点实验室,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,动物营养学国家重点实验室,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,动物营养学国家重点实验室,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽
医研究所,动物营养学国家重点实验室,北京100193;甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃兰州730070;
【正文语种】中文
【中图分类】S852.4
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）是引起慢性胃炎、消化道溃疡和胃黏膜相关
淋巴组织淋巴瘤的主要致病因素.早在1994年，世界卫生组织及国际癌症研究机
构（WHO／IARC）就将H.pylori定为Ⅰ类致癌原［1］.H.pylori还具有较高的感染率，发达国家感染率在40%以上，而发展中国家则高达50%以上［2］，我国
的平均感染率为54.76%［3］.现阶段治疗H.pylori感染主要是利用抗生素，但在临床上的治疗效果并不理想且容易复发，治疗费用较高，毒副作用大［4］.因此，寻求一种安全有效的预防和治疗H.pylori感染的方法，是现今医学界研究的热点. 免疫乳（immune milk）是指给哺乳动物（主要指牛、山羊）选择性的接种一些
能够引起人或动物疾病的细菌、病毒或其他一些外来抗原，刺激机体产生免疫应答以分泌特异性抗体或称为免疫球蛋白进入乳中，这种乳称为免疫乳［5］.因此，研究人员想到利用H.pylori疫苗免疫泌乳动物以得到功能性的乳品，以寻求更为安
全和有效的治疗预防H.pylori感染的方法［6－8］.但在利用 H.pylori全菌灭活疫苗免疫时，存在抗原成分不确定，副作用大等缺点［4］.有文献报道利用H.pylori 表位抗原制备疫苗来预防和治疗很可能会是一种更有效的手段［9－11］.通过对H.pylori几种亚单位抗原蛋白的研究表明，尿素酶B（UreB）具有较强的抗原性，并且其序列也具有较高的保守性［12］，在H.pylori的增殖和定植中有着重要作
用［13］，是较为理想的候选亚单位疫苗抗原蛋白.本试验拟基于已构建好的
H.pylori UreB表达载体进行表达，制备UreB的亚单位疫苗，并通过奶牛免疫制
备具有抗H.pylori UreB蛋白的功能性牛奶，以期为安全有效的治疗和预防
H.pylori感染提供新的途径.
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器
LB培养基、IPTG（Sigma，美国）、弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂（Sigma，美国）、四甲基联苯胺（TMB，Kehaoze，美国）、ELISA 间接测定试剂盒（Bethyl，美国）、蛋白测定试剂盒（Beyotime，美国）、酶标仪（Infinite
F200，Tecan，瑞士）、超声破碎仪（Scientz－ⅡD，Scientz，美国）、乳化器（Homogenizer Workcenter，美国）、96孔酶标板（Costar，美国）、全自动生化分析仪（Beckman Coulter，美国）、乳成分分析仪（Foss－Milkoscan TM Minor，美国）.
1.2 试验方法
1.2.1 UreB蛋白的表达利用本研究室前期构建的H.pylori UreB基因克隆菌［14］，经37℃过夜活化后，加入250μL浓度为1mmol／L的IPTG诱导3h，
3 000 g离心15min回收菌体，经超声破菌后，12 000 g离心10min.利用Buffer B（Triton 5%，Tris－HCl 50mmol／L，NaCl 50mmol／L，EDTA 5 mmol／L）重悬后静置3h，同样12 000 g离心10 min；8mol／L尿素 Tris－HCl（pH＝8.0）溶解蛋白，每步洗涤中间利用10mmol／L的Tris－HCl洗涤2次，每次静置10min.最后利用SDS－PAGE凝胶电泳检测其纯化效果，同时利用Bradford方法检测蛋白浓度.
1.2.2 UreB亚单位疫苗的制备将UreB蛋白溶解液与弗氏完全佐剂和弗氏不完全
佐剂等体积混合，利用乳化器进行乳化，制成弗氏完全佐剂疫苗和弗氏不完全佐剂疫苗.
1.2.3 奶牛免疫及样品采集选取正常泌乳荷斯坦奶牛（胎次：2～3次；泌乳日龄：
（152±45）d；产奶量：（23.2±5.4）kg／d）8头随机分为2组，每组4头，
分别为免疫处理组和空白对照组.首次免疫为弗氏完全佐剂疫苗，采取胯部两侧肌
肉注射，注射剂量为1mL，UreB蛋白浓度0.2mg／mL，空白对照组相同部位注射同等剂量的生理盐水，在注射后1周观察有无伤口发炎等症状.在初免后，每隔
2周利用弗氏不完全佐剂疫苗进行加强免疫.在免疫后第14、28、42、56d后采集乳样（早晚乳样按1∶1混合）.乳样采集后6 000 g，4℃离心15min，除去乳脂，－20℃保存待测.在免疫后第56d采集乳样50mL（早晚按1∶1混合，4℃保存），次日进行乳成分测定，同时尾动脉采集血样，凝血后3 000 g，15min离心分离
血清，－20℃保存待测.
1.2.4 奶牛饲喂及饲养管理按照牛场管理正常饲喂，使用TMR机统一饲喂，精粗比为45∶55，1d 3次，分别为7∶00、14∶00和21∶00；每天挤奶2次，时间分别为8∶00和17∶00；试验期间对试验奶牛未进行任何抗生素处理.
1.2.5 牛奶中特异性抗体效价的测定乳清中特异性抗体效价利用间接ELISA方法测定.用PBS（K2HPO414.03mmol／L，Na2HPO4·12H2O 43 mmol／L，NaCl 1.3mol／L，KCl 26.83mmol／L，pH7.4）将纯化后的UreB蛋白稀释至浓度为
40 μg／mL，在酶标板上每孔100μL，4℃过夜包被.次日除去包被液，利用PBS
洗涤5次；1%（V／V）的鸡血清每孔150μL，37℃，封闭90min.测定IgA及IgM时将样本从1∶200开始稀释到1∶12 800，IgG测定样本则从1∶10开始稀释至1∶105；同样除去封闭液后，PBS洗涤5次，每孔加样100μL，同时利用胎牛血清作为阴性对照，PBS为空白对照，37℃孵育90min；按试剂盒说明将酶标
二抗进行稀释，洗板后每孔加入100μL，37℃，孵育90min.加入TMB反应
20min，用2mol／L的H2SO4终止反应，每孔50μL，在吸光值为450nm下进行读数.抗体效价判定：PN＝（样品孔D值－空白孔D值）／（阴性对照孔D值
－空白孔D值）≥2为阳性，PN≥2的最小稀释倍数作为该血清的特异性抗体效价
（U），利用Lg（U＋1）转化其抗体效价进行统计分析［15］.
1.2.6 牛奶中常规成分的测定利用乳成分分析仪测定牛乳常规成分指标，包括乳中酪蛋白、总蛋白、乳脂肪、总固形物、非乳脂固形物、乳糖、游离脂肪酸.
1.2.7 奶牛血清中常规成分的测定利用全自动生化分析仪分析血清中各项血常规指标，主要指标包括白蛋白、谷丙转氨酶、血尿素氮、血糖、胆固醇、总胆红素、乳酸脱氢酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、游离脂肪酸、总蛋白、低密度脂蛋白.
1.3 数据处理
试验数据利用Excel 2007、SAS（8.2）GLM 程序进行统计分析.
2 结果与分析
2.1 UreB蛋白的表达和回收
经SDS－PAGE电泳检测，表明表达后UreB蛋白主要以包涵体的形式存在，利用8mol／L尿素Tris－HCl溶解后，在64ku处有较为明显的条带（图1），可判定为UreB蛋白，经Bardford法测定尿素酶蛋白浓度为0.39mg／mL.
图1 表达后UreB的SDS－PAGE图谱Fig.1 SDS－PAGE profile of urease B expressed product
2.2 抗幽门螺杆菌UreB亚单位疫苗对乳清中特异性抗体效价的影响
2.2.1 乳清中特异性抗体IgG效价由图2表明，在第1次免疫以后特异性抗体IgG效价开始上升，第4次免疫后达到最高，可达1∶1 600以上，与对照组差异显著（P＜0.05）.
图2 乳清中特异性抗体IgG效价Fig.2 Specific antibody IgG titer in whey
图3 乳清中特异性抗体IgM效价Fig.3 Specific antibody IgM titer in whey 2.2.2 乳清中特异性抗体IgM效价乳清中特异性抗体IgM效价的测定结果表明（图3），特异性抗体IgM变化较为缓慢，前3次免疫与对照组相比有所上升，但未达到显著（P＞0.05），但在第4次免疫后其效价显著高于对照组（P＜
0.05）.
2.2.3 乳清中特异性抗体IgA效价由图4可知，初次免疫后对乳清中的特异性抗体IgA效价影响不显著（P＞0.05），而在第2次免疫后，乳清中的特异性抗体IgA效价开始上升，在第4次免疫后，其效价可达1∶500以上，但与对照组差异不显著（P＞0.05）.
2.3 UreB亚单位疫苗对乳常规的影响
由表1可以看出，疫苗处理组中的各乳成分略高于空白对照组，除非乳脂固形物差异显著外（P＜0.05），其余各项指标差异均不显著（P＞0.05）.
图4 乳清中特异性抗体IgA效价Fig.4 Specific antibody IgA titer in whey
表1 UreB亚单位疫苗对牛奶乳成分的影响Tab.1 Effects of milk composition with UreB subunit vaccine同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P＜
0.05）.测定项目含量／%对照组免疫组Sx P 2.68±0.38 2.21±0.02 0.16 0.099总蛋白3.25±0.50 2.69±0.04 0.21 0.129脂肪3.90±1.34 3.43±1.20 0.73 0.525总固形物13.58±1.67 12.24±1.09 0.82 0.308非乳脂固形物8.63±0.30a
7.94±0.16b 0.14 0.025乳糖4.68±0.17 4.60±0.06 0.07 0.446游离脂肪酸酪蛋白5.16±1.48 4.54±0.69 0.67 0.543
2.4 UreB亚单位疫苗对奶牛血液中生理生化指标的影响
通过对免疫处理组和空白对照组的13项血液常规进行比较发现（表2），疫苗免疫处理后除总蛋白量、总胆红和D－3－羟丁酸素有所上升，但差异不显著（P＞0.05）；其余各项指标均低于空白对照组，差异也不显著（P＞0.05）.
表2 UreB亚单位疫苗对奶牛血常规成分的影响Tab.2 Effects of routine blood with UreB subunit vaccine of cows测定项目处理空白组免疫组 Sx P
1.47±0.20 1.30±0.05 0.080 0.238谷丙转氨酶／（IU·L－1）38.00±7.21 30.33±5.13 3.610 0.207血尿素氮／（mg·dL－1）17.33±
2.88 17.67±
3.21
1.760 0.900血糖／（mmol·L－1）3.96±0.14 3.88±0.28 0.130 0.704胆固醇／（mg·dL－1）206.67±68.70 139.67±40.72 3
2.610 0.220总胆红素／（mg·dL －1）0.33±0.05 0.40±0.00 0.023 0.116乳酸脱氢酶／（IU·L－1）
951.67±74.96 860.33±197.97 86.420 0.496谷草转氨酶／（IU·L－1）
74.33±4.72 59.00±17.34 7.340 0.214碱性磷酸酶／（IU·L－1）29.33±8.38 26.67±7.63 4.630 0.705游离脂肪酸／（mmol·L－1）0.74±0.03 0.74±0.04 0.020 0.786总蛋白／（g·dL－1）7.06±0.66 8.07±0.58 0.360 0.122低密度脂蛋白／（mg·dL－1）12.93±3.68 8.40±0.34 1.510 0.101 D－3－羟丁酸／（U·L －1）白蛋白／（g·dL－1）0.67±0.05 0.77±0.11 0.050 0.251
3 讨论
牛乳中的免疫球蛋白种类和浓度除与奶牛胎次、泌乳日龄、饲喂条件等相关外，同时还与免疫途径、免疫程序以及抗原种类等因素相关.张天哲等［8］利用H.pylori 的全菌疫苗在奶山羊上对3中不同免疫途径（滴鼻、多点皮下注射、妊娠期肌肉注射）进行了比较，发现3种途径都可引起IgG、IgA及IgM的升高，而利用妊娠期肌肉免疫途径可以显著的提高羊奶中IgG浓度，利用滴鼻免疫途径则可以显著提高IgA浓度.因此，选用合适的免疫途径也是影响免疫乳中抗体成分和浓度的重要因素.通过肌肉免疫途径可以有效的刺激机体脾脏淋巴结等免疫器官的B淋巴细胞产生IgG进入血液，并通过乳腺上皮细胞载体转运进入乳中，提高特异性抗体IgG浓度［16］.本试验中，利用亚单位疫苗进行肌肉注射途径免疫可以有效的刺激机体免疫反应，从第1次免疫后，就能显著（P＜0.05）提高乳中特异性抗体IgG的浓度.而IgA则主要是通过刺激机体的粘膜免疫器官，如鼻粘膜，胃肠道粘膜等粘膜免疫细胞产生，是机体粘膜局部抗感染免疫的主要抗体［17］.通过肌肉注射免疫途径可以刺激淋巴细胞B，随后由于淋巴细胞的归巢作用引起了其他粘膜部位出现的特异性IgA抗体，同时也包括外分泌腺（乳腺、泪腺及唾液腺等）
［18］.因此，本试验结果中显示通过肌肉注射免疫可以引起IgA的升高，但并不显著.IgM则主要以多聚体形式存在于血管中，因此对组织液或分泌液的保护力方
面作用可能不大，并且其主要在免疫应答初期产生［5］.本试验结果表明，在连续3次免疫后才能有效的提高乳中IgM浓度，这可能是与免疫耐受和免疫记忆有关，在初次免疫时牛奶中的特异性抗体IgM有所上升，但差异并不显著，随着连续加
强免疫后，其特异性抗体IgM浓度快速上升，且与对照组差异显著.结果还显示，空白对照组的乳清中也有一定的特异性抗体效价，这可能与奶牛瘤胃中的产脲酶微生物有关，已经有研究证明牛奶瘤胃内存在尿素酶，并且已经成功的分离和纯化出有活性的尿素酶蛋白［19－20］，因此瘤胃中存在的尿素酶很可能就是持续刺激
奶牛胃粘膜，引起牛奶中出现特异性抗尿素酶抗体的原因.但因为瘤胃中微生物种
类复杂，数量繁多，很难单独进行分离培养，现还很难定义产尿素酶菌中是否有H.pylori，还有待进一步的研究.
对牛奶中各成分的分析结果显示，对照组各项指标都略高于免疫处理组，其中除非乳脂固型物差异显著外，其余指标差异并不显著.研究表明，影响奶牛乳成分的因
素众多，包括奶牛品种、胎次、泌乳日龄、营养水平、身体状况、外界环境及有无患病等［21］.本试验中奶牛在泌乳日龄和胎次上存在个体间差异，但试验采取了
随机分组原则，消除了个体间差异对结果的影响；同时对试验奶牛在饲喂饲养和生产环境上进行统一化管理，并不会影响对照和处理间的乳成分结果，因此我们推测乳成分差异可能是与疫苗免疫有相关.刘光磊等［22］利用抗原缓释剂对奶牛乳品
质的影响研究表明，疫苗免疫过程中导致了奶牛采食量的下降，推测可能是因为在免疫过程中产生了应激反应，导致奶牛机体动员消耗糖、脂肪、蛋白等营养物质，但对奶牛中乳糖、乳脂、乳蛋白等没有显著差异.孙江涛等研究口蹄疫疫苗对乳成
分的影响结果表明，乳脂的变化差异不显著，免疫后2组牛奶中乳蛋白的含量有
下降趋势，试验组乳蛋白含量下降程度显著大于对照组，乳非脂固形物、乳比重、
乳糖和乳灰分的变化趋势相似，都比免疫前有降低，但差异不显著［23］.本试验
结果与上述研究成果相似.在本试验中，很可能是因为免疫刺激引起了奶牛机体的
应急反应，动员了体内糖、脂肪、蛋白的分解，从而降低了乳中的各指标，但差异并不显著.在通过对血清中各项生理生化指标结果的分析表明，各指标变化并没有
规律，同时其差异也不显著，说明对奶牛的健康没有显著影响.
参考文献
［1］Vandenplas Y.Helicobacter pylori infection［J］.World J Gastroenterol，2000，6（1）：20－31
［2］邹全明，曾浩.幽门螺杆菌感染的免疫防治［J］.医学与哲学，2007，28（6）：25－27
［3］张万岱，胡伏莲，萧树东，等.中国自然人群幽门螺杆菌感染的流行病学调查［J］.现代消化及介入诊疗，2010，15（5）：265－270
［5］张和平，郭军.免疫乳科学与技术［M］.北京：中国轻工业出版社，2002：112－115
［6］Cordle C T，Shaller J P，Krakowka.Bovine antibodies to Helicobacter pylori as a possible treatment for gastritis and peptic ulcer disease in humans［M］.In：Indigenous Antimicrobial Agents of Milk－Recent Development，IDF，Uppsala，Sweeden，1993：131－132
［7］Korhonen H，Syväoja E L，Ahola－Luttila H，et al.Helicobacter pylori －specific antibodies and bactericidal activity in serum，colostrum and
milk of immunized and non－immunized cows［J］.J Appl Bacteriol，1995，78（6）：655－62
［8］张天哲，袁聚祥，徐应军，等.幽门螺杆菌免疫奶羊的应答性实验研究［J］.
免疫学杂志，2004，20（6）：443－449
［9］Carlsohn E，Nystrom J，Bolin I，et al.HpaA is essential for Helicobacter pylori colonization in mice［J］.Infect Immun，2006，74（2）：920－926.
［10］Shi Y，Wu C，Zhou W Y，et al.Identification of H－2d restricted Th epitopes in urease B subunit of Helicobacter pylori［J］.Vaccine，2007，
25（14）：2583－2590
［11］Liu X L，Li S Q，Liu C J，et al.Antigen epitpoe of Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin A［J］.World J Gastroenterol，2004，10（16）：2340－2343
［12］刘建东.幽门螺杆菌尿素酶临床应用和疫苗研制进展［J］.国际消化病杂志，2006，26（2）：98－101
［13］汤艳超.幽门螺杆菌相关保护性抗原［J］.微生物学免疫学进展，2010，38（2）：62－65
［14］赵圣国，王加启，卜登攀，等.奶牛瘤胃微生物BAC文库中脲酶克隆的筛选与分析［J］.中国农业大学学报，2008，13（6）：61－65
［15］Shu Q，Bir S H，Gill H S，et al.Antibody response in sheep following immunization with streptococcus bovis in different adjutants ［J］.Vet Res Commun，2001，1：43－54
［16］董晓丽，王加启，赵国琦，等.牛奶中免疫活性蛋白的研究进展［J］.中国
畜牧兽医，2008，35（2）：67－71
［17］唐恩洁.医学免疫学［M］.成都：四川大学出版社，2004：51－50 ［18］Paul W E.免疫基础学［M］.吴玉章译.北京：科学出版社，2003：1019－1021
［19］Kakimoto S，Okazaki K，Sakane T，et al.Isolation and taxonomic
characterization of acid urease－producing bacteria［J］.Agr and Bio Chem，1989，53（4）：1111－1118.
［20］赵圣国，王加启，刘开朗，等.荷斯坦奶牛瘤胃微生物脲酶的分离与鉴定［J］.畜牧兽医学，2010，41（6）：692－696
［21］邹彩霞，杨炳壮，韦升菊，等.水牛乳能值与乳成分的相关性研究［J］.动物营养学报，2010，22（4）：964－968
［22］刘光磊，王加启，丁庆，等.埋植抗原缓释剂（ARD）对奶牛生产性能及乳品质的影响［J］.中国奶牛，2007（S1）：17－20
［23］孙江涛，程大庆，郭成林，等.注射口蹄疫疫苗对泌乳牛生产性能的影响［J］.中国奶牛，2009（5）：40－42。