实验设计钙离子对小麦氯化钠胁迫培养的缓解作用

实验设计钙离子对小麦氯化钠胁迫培养的缓解作用
植物生理学实验技能测试（设计性实验）
姓名：徐斌
学号：2010025143
班级：2010级农资班
实验时间：2012.6.6-2012 .
外源Ca2+ 对小麦盐胁迫培养的缓解作用
一、实验目的
1、了解盐胁迫对植物的生理效应；
2、掌握钙离子对小麦氯化钠胁迫培养缓解作用的实验原理及方法；
3、熟练掌握分光光度计的使用方法。

二、实验原理
在盐胁迫下,作物氮素同化能力降低,造成氮素营养的相对缺乏。

盐胁迫下小麦幼苗的生长受到明显抑制,表现在鲜重、叶绿素和可溶性蛋白含量的降低。

盐胁迫对小麦的光合作用具有抑制效应，而且随外界盐浓度的提高，被抑制的程度也越大，通常在盐胁迫下, 盐胁迫下小麦叶片中叶绿素含量和类胡萝卜素总量下降。

低盐胁迫下,外源施加适量的Ca2+ ,明显促进了鲜重、叶绿素和可溶性蛋白含量的增加,表现出对盐胁迫一定的缓解效应,所以对小麦进行叶绿体色素含量的测定，可以分析出钙离子对小麦氯化钠胁迫培养的缓解作用。

但在叶绿素提取液中同时含有叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素，三者的吸收光谱虽有不同，但又存在着明显的重叠，在不分离他们的情况下同时测定叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的浓度，可分别测定在663nm、645nm、470 nm （分别是叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素在红光区的吸收峰）的光吸收，然后根据Lambert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素a、叶绿素b、和类胡萝卜素的浓度。

Ca=12.21A
663-2.81A
645
（1）
Cb=20.13A
645-5.03A
663
（2）
CT=Ca+Cb=8.05A
663+20.29A
645
（3）
Cx.c=(1000D
470
-3.27Ca-104Cb)/229 （4）
注：Ca——叶绿素a的浓度（单位为mg/L）
Cb——叶绿素b浓度（单位为mg/L）
CT——叶绿素的总浓度（单位为mg/L）
Cx.c——类胡萝卜素浓度（单位为mg/L）
三、实验器料
1、材料:小麦种子（无盐胁迫、盐胁迫、缓解后的小麦叶片）、培养皿两个、纱布；
2、试剂：
0.3%高锰酸钾溶液、80%丙酮溶液、CaCO3、石英砂、2%NaCl 溶液、4.0g/L Ca(NO3)2溶液、自来水；
3、仪器：分光光度计（分光光度计的使用）、离心机。

四、实验步骤
1、小麦种子的培养
(1)挑选大小一致、饱满的小麦种子用0.3%高锰酸钾溶液消毒5—10 min, 然后置于铺有一层纱布于培养皿内, 每皿平铺一薄层,试验采用两个组，一个实验组，一个对照组；先加注适宜的自来水培养7天，并观察记录小麦生长情况。

（2）第7天时，分别取小麦叶片测定其叶绿素含量；
（3）第7-11天在实验组中加1.2%NaCl溶液培养4天，对照组仍加自来水培养。

并观察记录小麦的成长情况；
（4）第11天时，分别取小麦叶片测定其叶绿素含量；
（5）第11-14天在实验组中加4.0g/L Ca(NO3)2溶液培养，第14天时取小麦叶片测定其叶绿素含量，培养期间观察记录小麦的生长情况。

向小麦种子中所加的培养液情况表
组别
培养液
0-7天7-11天11-14天
实验组自来水 1.2%NaCl溶液 4.0g/L Ca(NO3)2溶液
对照组自来水
3、小麦叶绿体色素的测定
（1）、提取叶绿素
选取在不同情况下培养的小麦叶片，各称取0.2g剪碎后置于研钵中，加入5ml 80%丙酮，少许CaCO3和石英砂。

充分研磨（组织变白），再加10ml 80%丙酮，静止3-5分钟，冲洗研钵后转至离心管，定容至15ml,用离心机离心15分钟（3000转），取上清液用80%丙酮定容至25ml。

（两种条件下培养的小麦，各取两个样品进行测定）。

（2）、测定OD值
取各上清液1ml，加80%丙酮4ml，以80%丙酮作空白对照，用分光光度计分别测定叶绿素提取液在645nm、663nm、470 nm下的吸光度。

（3）、计算：把测出的吸光值带入(1)(2)(3)式计算叶绿素a、b、a+b的浓度。

根据下式求出小麦叶绿素的含量：
叶绿素的含量（mg/g)=（c×v×n）/m
C—叶绿素的浓度（mg/L)； v—提取液体积(ml)；
n—稀释倍数； m—样品鲜重（g)
五、实验现象记录
1、小麦的生长发育观察
实验开始后（小麦培养），观察小麦生长状况（颜色、植株高度），并填入下表。

小麦生长状况记录表：
组别实验组对照组
观察内容叶片颜色随机20株平均
高度（cm）
叶片颜色
随机20株平均
高度（cm）
观察时间
第3天嫩黄色 2.5 嫩黄色 2.5 第7天绿色8.3 绿色8.3 第11天黄绿色9.0 绿色11.2 第14天绿色10.8 绿色13.1
六、实验数据记录及计算结果
1.盐胁迫前测定记录：
组号鲜重
（g）
吸光度色素浓度（mg/L）D663D645D470ａｂａ＋ｂ
实验组0.2040 0.125 0.058 0.121 1.363 0.539 2.183
对照组0.2013 0.109 0.050 0.101 1.190 0.378 1.892
计算如下：
实验组：Ca=12.21×0.125－2.81×0.058﹦1.363 mg/l
Cb=20.13×0.058－5.03×0.125﹦0.539 mg/l
CT=Ca﹢Cb=8.05×0.125﹢20.29×0.058﹦2.183 mg/l
叶绿素的含量（mg/g)=（c×v×n）/m﹦（2.183×125×0.025）/0.2040﹦33.441 mg/g
对照组：Ca=12.21×0.109－2.81×0.050﹦1.190 mg/l
Cb=20.13×0.050－5.03×0.109﹦0.378 mg/l
CT=Ca﹢Cb=8.05×0.109﹢20.29×0.050﹦1.892 mg/l
叶绿素的含量（mg/g)=（c×v×n）/m﹦(1.892×125×0.025）/0.2013﹦29.37 mg/g
2.盐胁迫后测定记录：
组号鲜重
（g）
吸光度色素浓度（mg/L）D663D645D470ａｂａ＋ｂ
实验组0.2101 0.093 0.044 0.118 1.012 0.418 1.641 对照组0.2020 0.122 0.051 0.123 1.346 0.413 2.017
计算如下：
实验组：Ca=12.21×0.093－2.81×0.044﹦1.012 mg/l
Cb=20.13×0.044－5.03×0.093﹦0.418 mg/l
CT=Ca﹢Cb=8.05×0.093﹢20.29×0.044﹦1.641 mg/l
叶绿素的含量（mg/g)=（c×v×n）/m﹦(1.641×125×0.025）/0.2101﹦24.408 mg/g
对照组：Ca=12.21×0.122－2.81×0.051﹦1.346 mg/l
Cb=20.13×0.051－5.03×0.122﹦0.413 mg/l
CT=Ca﹢Cb=8.05×0.122﹢20.29×0.051﹦2.017 mg/l
叶绿素的含量（mg/g)=（c×v×n）/m﹦(2.017×125×0.025）/0.2020﹦31.204 mg/g
3.缓解后测定记录：
组号鲜重
（g）
吸光度色素浓度（mg/L）D663D645D470ａｂａ＋ｂ
实验组0.2120 0.094 0.048 0.092 1.013 0.493 1.730 对照组0.2011 0.112 0.049 0.079 1.230 0.423 1.896
计算如下：
实验组：Ca=12.21×0.094－2.81×0.048﹦1.013 mg/l
Cb=20.13×0.048－5.03×0.094﹦0.493 mg/l
CT=Ca﹢Cb=8.05×0.094﹢20.29×0.048﹦1.730 mg/l
叶绿素的含量（mg/g)=（c×v×n）/m﹦(1.730×125×0.025）/0.2102﹦25.720 mg/g
对照组：Ca=12.21×0.112－2.81×0.049﹦1.230 mg/l
Cb=20.13×0.049－5.03×0.112﹦0.423 mg/l
CT=Ca﹢Cb=8.05×0.112﹢20.29×0.049﹦1.896 mg/l
叶绿素的含量（mg/g)=（c×v×n）/m﹦(1.896×125×0.025）/0.2011﹦29.463 mg/g
4、把三次叶绿素含量测定的值记入下表
组号
小麦组织中叶绿素含量（mg/L)
第一次第二次第三次实验组33.441 24.408 25.720
对照组29.37 31.204 29.463
七、实验分析及小结
1.实验分析
对三次叶绿素的测定结果比较，可看出盐胁迫下小麦幼苗的生长受到明显抑制,叶片内叶绿素含量明显下降，当外源施加适量的Ca2+,促进了叶绿素含量的增加,表现出对盐胁迫一定的缓解效应,可见硝酸钙可缓解盐对小麦的胁迫，使小麦减轻盐害。

2.实验小结
（1）通过本次试验我们了解了盐胁迫对小麦的生理效应，掌握了钙离子对小麦盐胁迫培养缓解作用的实验原理及方法；并且能够熟练地掌握分光光度计的使用方法。

（2）本次试验存在很多误差，比如说用自来水培养小麦，自来水中也存在少量的钙离子，对实验结果也会造成影响。

（3）通过三次对试验组叶绿素的三次测定值进行比较，可看出当加入外源硝酸钙溶液来缓解盐胁迫培养时，效果不是很明显，我认为这主要是缓解培养的天数太短。

3.减小误差的方法
(1)由于小麦叶片中含有水分，固先用纯丙酮进行提取，以使色素提取液中丙酮的最终浓度近似80%；
(2)为了避免叶绿素的光分解，操作时应该在弱光下进行，研磨时间应尽量短些；
(3)由于叶绿素a和叶绿素b的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，
就会使结果产生很大的误差，因此最好用波长较正确的高级型分光光度计。

八、思考题
1、讨论Ca2+在提高植物抗盐性中的作用有哪些？
答：低盐胁迫下,外源施加适量的Ca2+ , 一方面可以缓解因Ca2+不足造成的矿质营养胁迫, 另一方面适量的Ca2+能够增强质膜的稳定性和钙信号系统的正常发生和传递, 阻止细胞内K+的外流和Ca2+的大量进入, 以维持细胞内离子平衡。

Ca2+明显促进了鲜重、叶绿素和可溶性蛋白含量的增加,表现出对盐胁迫一定的缓解效应。

2、盐胁迫下对小麦生长有何影响？
答：在盐胁迫下,作物氮素同化能力降低,造成氮素营养的相对缺乏。

盐胁迫下小麦幼苗的生长受到明显抑制,表现在鲜重、叶绿素和可溶性蛋白含量的降低。

盐胁迫对小麦的光合作用具有抑制效应，而且随外界盐浓度的提高，被抑制的程度也越大，通常在盐胁迫下小麦叶片中叶绿素含量和类胡萝卜素总量下降。

高浓度的盐胁迫可能造成植物死亡。

【参考文献】
【1】王志强, 丁立, 徐晋豫, 梁威威, 林同保. 蔗糖预处理对盐胁迫小麦幼苗氮同化的影响. 河南农业大学学报, 2008, 42 (3) : 268～272.
【2】王志强, 王春丽, 林同保. 外源钙离子对小麦幼苗氮素代谢的影响. 生态学报, 2008, 28 (8) : 3662～3667
【3】杨善元. 关于测定叶绿素含量及a:b值等若干问题，植物生理学通讯
【4】佟友丽, 冯君伟, 李玉花. 植物抗盐胁迫研究进展. 生物技术通讯, 2008, 19 (1) : 138～140.
【5】何龙飞, 沈振国, 刘友良. 铝胁迫下钙对小麦根液泡膜功能和膜脂组成的影响. 南京农业大学学报, 2000, 23 (1) : 10～13.
【6】谷艳芳, 丁圣彦, 李婷婷, 王欣, 李俊娇, 张丽霞. 盐胁迫对冬小麦幼苗干物质分配和生理生态特性的影响. 生态学报, 2009, 29 ( 2) :840~845.
【7】赵旭, 王林权, 周春菊, 尚浩博. 钙离子对两种基因型冬小麦萌发过程中盐胁迫效应的影响. 土壤通报, 2006, 37 ( 4) : 748~752.
【9】朱晓军, 杨劲松, 梁永超, 娄运生, 杨晓英. 盐胁迫下钙对水稻幼苗光合作用及相关生理特性的影响. 中国农业科学, 2004, 37 ( 10) :1497~1503.
【10】周丽艳,秦子禹外源钙对海水胁迫下小麦种子萌发及幼苗生长的缓解作用，2012 年1 月第1 期.。