Western Blot 实验方案

Western Blot 实验方案
1上样并电泳，上样必须包括标准蛋白MARKER。

2准备膜，如果是PVDF膜，首先在甲醇中浸泡5秒（膜变透明）；如果是NC膜，须在转膜液半个小时。

3跑完胶，置胶于转膜液中4～5分钟，标记上样顺序。

4把膜和滤纸事先泡于转膜液中，膜也事先切去掉一小三角。

5黑面往下平放夹子，依次按滤纸（三层）-蛋白胶-WB膜（三层），最后三层滤纸。

去掉气泡。

注意滤纸比WB膜要小，以免短路。

6夹好夹子，对正确的颜色放好转膜槽。

250m M电流转膜2个小时，加入冰袋使转膜槽保持低温。

7转膜结束，加入丽春红染色10min，对蛋白MARKER 位置用铅笔标记。

8回收丽春红染色液，把膜置于自来水中脱色，加入5%脱脂奶粉PBST缓慢震荡封闭1个小时，注意溶液覆盖住膜。

9 PBST洗膜三次，每次10min。

10 用含1%脱脂奶粉PBST稀释一抗到适当浓度，置于室温孵育1小时。

11 PBST洗膜三次，每次10min。

12用含1%脱脂奶粉PBST稀释二抗到适当浓度，置于室温孵育1小时。

13加入PBST洗膜三次，每次10min。

14加入底物反应5min, 显色拍照。

试剂配方
1转膜液
于1000ml 烧杯中加入
Glycine 2.9g
Tris 5.8g
SDS 0.37g
双蒸水600ml
定容至800ml后，加入200ml甲醇。

2丽春红染色液
Poneau S 0.1g
Acetic acid 5ml
加入双蒸水定容至100ml
3封闭液
脱脂奶粉 5
PBST 定容至100ml
4度冰箱保存
注意事项
1跑完胶后，玻璃板请清洗干净并凉干，转完膜后，请将电泳槽清洗干净。

2显色后，请将膜凉干取走，即使是没有条带的膜。

3请配SDS PAGE蛋白胶后，立即将溶液（丙烯酰胺，TEMED, 过硫酸铵）放回冰箱。

4 酶标二抗可在一个星期内反复用5次，每次用完后请作好标记放冰箱。

5底物BCIP/NBT药片底物溶液可在一周内反复用多次，每次用完后请作好标记放冰箱。