油棕猝倒病菌实时荧光PCR检测方法

油棕猝倒病菌实时荧光PCR检测方法
张慧丽;王建峰;段维军;徐瑛;高姗姗;陈先锋
【摘要】油棕猝倒病菌(Pythiums plendens)是我国进境植物检疫性有害生物.本试验根据P.splendem rDNA ITS区序列,设计了实时荧光PCR引物pyspF/pyspR 及荧光探针pyspT,建立了P.splendens荧光PCR检测方法,检测灵敏度为0.012 pg/μL.%Pythium splendens is one of the entry plant quarantine pests in China. The specific primer sets pyspF/ pyspR and TaqMan probe pyspT were designed based on the region of ITS of P. splendens. The technique of realtime fluorescent PCR was established to detect P, splendens, Experimental results showed that the limits of detection for P. splendens were 0. 012 pg /μL.
【期刊名称】《植物保护》
【年(卷),期】2012(038)006
【总页数】3页(P98-100)
【关键词】油棕猝倒病菌;实时荧光PCR
【作者】张慧丽;王建峰;段维军;徐瑛;高姗姗;陈先锋
【作者单位】宁波出入境检验检疫局,宁波315012;宁波出入境检验检疫局,宁波315012;宁波出入境检验检疫局,宁波315012;宁波出入境检验检疫局,宁波315012;宁波大学,宁波315211;宁波出入境检验检疫局,宁波315012
【正文语种】中文
【中图分类】S432.44
华丽腐霉（Pythium splendens Braun）引起的油棕猝倒病是油棕上的一种重要真菌病害［1］，该病菌寄主范围很广，除侵染油棕苗以外，还能危害上百种经济作物，引起寄主幼苗整株失水萎蔫［2］。

它主要分布在比利时、法国、德国、意大利、荷兰、日本、坦桑尼亚、刚果和美国的夏威夷、佛罗里达、宾夕法尼亚州，国内台湾、海南曾有报道［2－4］，但其他地区未见发生报道。

该病菌通过带菌土壤、生长介质和营养繁殖材料传播。

在2007年被列入中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录。

针对P.splendens的检测已有特异性引物［5］、PCR－RFLP［6］、核糖体DNA序列分析［4］等方法。

随着分子生物学技术的发展，实时荧光PCR以其具有的高特异性、高灵敏度以及快速的优点越来越多地应用于疫病的检测。

真核生物核糖体 DNA（rDNA）由18S、ITS1（internal transcribed space）、5.8S、ITS2 和 28S构成，头尾串联形成重复序列，一个基因组内有60～200个拷贝。

ITS1和ITS2常被合称为ITS，并且5.8SrDNA基因也被包括在ITS之内。

rDNA上5.8S、18S和28SrDNA基因序列进化缓慢而相对保守，但这三个基因序列之间的ITS序列的进化则相当迅速，因而rDNA序列广泛用于真菌各级水平的系统学研究［7］。

本研究通过对病原菌及相关种的rDNA ITS序列进行比较分析，设计了针对P.splendens的引物和探针，建立了P.splendens实时荧光PCR 检测方法，为口岸检验检疫提供快速、准确的检测技术。

1 材料和方法
1.1 菌株
供试菌株包括了腐霉属12种、疫霉属2种以及一些常见真菌、细菌共17种21个菌株。

菌株编号和来源见表1。

表1 参试菌株及来源?
1.2 DNA提取
将供试真菌菌株采用CTAB法提取总DNA［8］，细菌菌株采用TaKaRa minibest bacterial genomic DNA extraction kit ver.2.0 试剂盒提取 DNA，－20℃保存备用。

1.3 PCR检测
1.3.1 引物及探针的设计与合成
使用Bioedit软件对GenBank中的病原菌及相关种的rDNA ITS序列进行比较分析，找出保守序列，应用 Primer Express 5.0设计P.splendens的引物和探针。

实时荧光PCR引物pyspF序列为5′－TTAAATGGACAGGGTCTTTCTAT－3′，pyspR序列为5′－TGCCGAAGTCGCCAAAAG－3′，Taqman探针 pyspT 序列为5′－CGAGCACCACACTTCACACAG－3′，探针5′端标记的荧光报告基团为FAM，3′端标记的荧光猝灭基团为TAMRA。

荧光探针与引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.3.2 实时荧光PCR反应体系和程序
PCR反应总体积为25μL，各成分为：1×Premix Ex TaqTM（大连宝生物），引
物0.5μmol／L，探针0.2μmol／L，校正荧光ROX 0.2μmol／L。

在ABI 7900
定量PCR仪（美国ABI）上进行PCR反应。

反应条件为：50℃预热2min；95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。

实时荧光PCR利用ABI 7900型荧光定量PCR仪自带软件SDS3.0（版本号）进行结果分析，根据阴性对照结果设定阈值线，扩增曲线及样品Ct值由软件自动生成。

1.3.3 特异性检测
以表1中菌株的基因组DNA为试验材料，用P.splendens的种特异性引物PyspF／PyspR及探针PyspT行实时荧光PCR检测，并设置空白对照。

1.3.4 灵敏度检测
为确定油棕猝倒病菌实时荧光PCR的检测限度，将菌株 ATCC96757 的 DNA 稀
释成12、1.2、0.12、0.012、0.001 2、0.000 12、0.000 012、0.000 001 2ng ／μL 8个不同浓度，分别用引物PyspF／PyspR及探针PyspT进行实时荧光PCR 检测。

2 结果与分析
2.1 华丽腐霉的特异性检测
对表1所列供试菌株进行实时荧光PCR检测结果表明，只有P.splendens的5个菌株的模板检测到信号增加，扩增反应呈阳性，而其他参试菌株及空白对照在40
个扩增周期内未见信号增长，扩增反应呈阴性（图1）。

实时荧光PCR特异性良好。

图1 油棕猝倒病菌实时荧光PCR特异性扩增结果
2.2 灵敏度检测试验
对不同稀释度的P.splendens DNA样品，采用实时荧光PCR检测，结果表明，
实时荧光PCR方法对低至0.012pg／μL的DNA样品有明显扩增（图2），系列稀释的扩增曲线的Ct值在12～38之间，扩增曲线典型。

方法的重复性良好。

同时，DNA稀释度与Ct值呈良好的相关性，其相关系数0.999 5，相邻10倍稀释
度的Ct值差为3.58左右（图3），结果可靠。

3 讨论
一直以来，形态学分类在腐霉分类中占主要地位，近年来随着分子生物学技术的发展，生物技术已经逐渐成为腐霉属菌物分类的一种重要的辅助工具，应用于
P.splendens的分子方法包括特异性引物、PCR－RFLP、核糖体DNA序列分析等。

形态学鉴定有经验性强、耗时长等缺点；已有的分子生物学方法中特异性引物的灵
敏度不高，在研究过程中我们采用 Wang等［6］设计的特异性引物对DNA浓度为12ng／μL的样品进行检测，结果无扩增。

PCRRFLP需要PCR扩增后再进行后续检测，耗时较长；核糖体DNA序列分析，扩增好的PCR产物需要送到专业公司进行测序，虽然获得的信息量大，但是耗时更长。

而实时荧光PCR检测方法正好克服了以上的缺点，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，具有检测周期短、特异性与灵敏度高以及无需PCR后处理等优点。

目前，还未见
P.splendens实时荧光检测方法的报道。

本研究建立的实时荧光PCR检测方法特异性强、灵敏度高。

符合口岸检测快速、准确的要求。

参考文献
［1］ Aderungboye F O，Esuruoso O F.Ecological studies on Pythium splendens Braun in oil palm（Elaeis guineensis Jacq.）plantation soils ［J］.Plant and Soil，1976，44（2）：397－406.
［2］ CMI.Descriptions of pathogenic fungi and bacteria
［M］.Commonwealth Mycological Institute，Kew，United Kingdom，1966，No.120.
［3］ Fu C H，Chen C M，Hsieh H J.First report of formosan michelia seedling root rot caused by Pythium splendens in Taiwan［J］.Plant Disease，2005，89（12）：1361.
［4］陈秀贤，曾会才，何汉兴，等.海南腐霉新记录种Pythium splendens的鉴定及其对油棕苗的致病性测定［J］.云南农业大学学报，2008，23（3）：321－324.
［5］ Wang P H，Wang Y T，White J G.Species－specific PCR primers for Pythiumdeveloped from ribosomal ITS1region［J］.Letters in Applied Microbiology，2003，37（2）：127－132.
［6］ Wang P H，White J G.Molecular characterization of Pythium species based on RFLP analysis of the internal transcribed spacer region of ribosomal DNA［J］.Physiological and Molecular Plant Pathology，1997，51（2）：129－143.
［7］陈剑山，郑服丛.ITS序列分析在真菌分类鉴定中的应用［J］.安徽农业科学，2007，35（13）：3785－3786.
［8］易润华，朱西儒，周而勋.简化CTAB法快速微量提取丝状真菌DNA［J］.湛江海洋大学学报，2003，23（6）：72－73.。